Данио рерио Всего горе высокого разрешения двумя люминесцентными В Ситу Гибридизация
25 марта 2009 г.
Всего монтирования в гибридизация является одним из наиболее широко используемых методов в биологии развития. Здесь мы представляем высоким разрешением двумя люминесцентными на месте протокол гибридизации для анализа точных выражению одного гена и для определения перекрытия выражение доменов двух генов. Мы включаем пропидий йодида ответного ядерного пятно, чтобы выделить ткани организации.
Данная процедура позволяет определять паттерны экспрессии генов в эмбрионах zebrafish с высоким разрешением; антисмысловой рибозонд гибридизуется с комплементарной целевой мРНК. Маркированный рибозонд распознается антителом, конъюгированным с ферментом пероксидазой; эмбрионам добавляют конъюгированный с арамидом флуоро-четыре, и пероксидаза превращает IDE в высокореактивное соединение. Это приводит к стабильному осаждению флуоро-четыре; несвязанный IDE вымывается, выявляя детальный субклеточный паттерн распределения мРНК.
Экспрессию второго гена можно наблюдать с помощью зонда с отличной меткой и другого флуорофора, что позволяет провести детальное сравнение экспрессии. Здравствуйте, я Тим Брент из лаборатории Скотта Холли с кафедры молекулярной, клеточной и биологии развития Йельского университета. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру двухцветной флуоресцентной гибридизации in situ высокого разрешения на целых эмбрионах zebrafish.
Данная процедура используется нами для изучения сегментации у zebrafish. Приступим к работе. Начните процедуру с эмбрионов, которые были зафиксированы в параформальдегиде в холоде в течение ночи.
Для успешного окрашивания крайне важно использовать свежеразмороженный стоковый раствор параформальдегида для данной фиксации. Удалите фиксирующий раствор и промойте эмбрионы при комнатной температуре дважды по пять минут каждый раз в PBS. Затем удалите хорион эмбрионов.
Эмбрионы помещают в стеклянные луночные планшеты. Далее, используя часовой пинцет, удалите Corian. Для переноса эмбрионов используйте стеклянную пастуральную пипетку с оплавленным концом.
В противном случае эмбрионы прилипнут к обычным полипропиленовым наконечникам. Дехлорированные эмбрионы переносят через серию промывок с возрастающей концентрацией метанола. Последняя промывка проводится в 100% метаноле.
Наконец, эмбрионы помещают в свежий метанол и хранят при температуре минус 20 °C в течение ночи. На следующий день перенесите эмбрионы через серию промывок с постепенно снижающейся концентрацией метанола, а затем дважды промойте их буфером PBST по пять минут. Затем зафиксируйте эмбрионы в параформальдегиде в течение 20 минут.
Завершите кратковременную фиксацию двумя пятиминутными промывками в растворе PBST. Теперь можно приступить к пермеабилизации эмбрионов. Для обеспечения проницаемости фиксированных эмбрионов их инкубируют с белком ACE K. Убедитесь, что микроцентрифужная пробирка лежит на боку.
Продолжительность этапа переваривания зависит от возраста эмбриона. Например, эмбрионы на стадии соматогенеза инкубируют от трех до четырех минут. Кратковременно промойте в PBST, затем промойте один раз в PBST в течение пяти минут.
Зафиксируйте эмбрионы в параформальдегиде. В завершение дважды промойте эмбрионы в PBST в течение пяти минут. Теперь эмбрионы готовы к гибридизации с РНК-зондами.
После фиксации и пермеабилизации эмбрионов мы приступаем к процессу гибридизации с пятиминутной инкубацией в растворе High Minus при 65 °C. Не забудьте предварительно нагреть раствор HIIN перед использованием. Затем инкубируйте эмбрионы в растворе High Plus в течение одного часа.
Снова напомним о необходимости предварительного нагрева раствора HyPlus. Теперь удалите большую часть раствора HyPlus, оставив 50 µL, при этом убедитесь, что эмбрионы полностью погружены в жидкость. Добавьте по 1 µL каждого зонда и перемешайте, аккуратно встряхнув пробирку.
Отныне накрывайте пробирки алюминиевой фольгой. Поскольку флуоресцеин чувствителен к свету, а гибридизация проводится при инкубации в течение ночи при 65 °C, процесс гибридизации завершен. Теперь приступим к удалению избытка зондов.
Детергент удаляют для улучшения качества окрашивания. Однако обратите внимание, что в отсутствие детергента эмбрионы становятся липкими. Промойте дважды 50% раствором формамида в 2X SSC, выдерживая по 30 минут при каждой промывке.
Промойте один раз и дважды раствором 2X SSC в течение 15 минут. В завершение промойте дважды раствором 0,2X SSC по 30 минут за каждую процедуру. Далее мы приступим к визуализации каждого зонда.
Теперь можно приступить к детекции гибридизованных зондов. Сначала детектируют флуоресцеиновый зонд, так как он менее стабилен и дает более слабый сигнал, чем дигоксигенин-зонд. Сначала проведите блокировку, добавив 500 µL 2% блокирующего реагента в малеиновом буфере, и выдержите в течение одного часа при комнатной температуре.
Затем добавьте антитела к флуоресцеину, конъюгированные с пероксидазой, в разведении 1:500 в блокирующем растворе. Инкубируйте в течение ночи при температуре 4 °C. Убедитесь, что микроцентрифужная пробирка лежит на боку.
Затем начните детектирование с использованием системы усиления сигнала Tyrom (TSA TYROM), в которой TYROM IDE конъюгирован с флуорофором. Пероксидаза хрена, связанная с антителом, превращает TY IDE в высокореактивный интермедиат. Реактивный TY IDE образует ковалентную связь с остатками, находящимися в непосредственной близости от антитела, что приводит к локальному осаждению флуорофора.
Начните с четырех 20-минутных промывок 1x буфером с малеиновой кислотой при комнатной температуре, после чего дважды промойте в PBS. Флуоресцеиновый TY IDE предварительно растворяли в DMSO для хранения. Кратковременно центрифугируйте данный субстрат TSA.
Затем разведите субстрат TSA в буфере для разведения при амплификации в соотношении 1:50. Добавьте раствор к эмбрионам и инкубируйте в течение 45 минут. Положите микроцентрифужную пробирку на бок.
На этом этапе инкубации перенесите эмбрионы через серию 10-минутных промывок с возрастающей концентрацией метанола. Последняя промывка проводится в течение 10 минут в 100% Methanol; затем инкубируйте в течение 30 минут в растворе 1% hydrogen peroxide для инактивации пероксидазы антитела. В противном случае это может помешать детекции dig oxygen in.
Перенесите эмбрионы с помощью зонда через серию промывок с постепенным снижением концентрации метанола, а затем проведите две промывки в PBS-буфере по 10 минут. Это обеспечит полное удаление метанола. Маркировка антителами dig xigen и зонда начинается с блокировки, аналогично процедуре с предыдущим антителом.
Затем добавьте антитела к dig-оксигенину в разведении 1:1000. Положите микроцентрифужную пробирку на бок и инкубируйте в холоде в течение ночи. На следующий день промойте образец буфером с малеиновой кислотой при комнатной температуре.
Затем с помощью PBS быстро промойте субстрат SCI five tyrom. Разведите его в пропорции 1:50 и добавьте к эмбрионам. Инкубируйте в течение 45 минут, положив пробирку на бок.
Наконец, трижды промойте в PBST. Завершающий этап окрашивания пропидиум иодидом позволяет маркировать ядра. Начните с двух пятиминутных промывок в 2X SSC.
Затем инкубируйте с РНК в течение 30 минут при 37 °C. Шестикратно промойте в 2X SSC при комнатной температуре, после чего добавьте раствор пропидия иодида и окрашивайте в течение восьми минут. Снова шестикратно промойте в 2X SSC.
Фиксируйте эмбрионы в параформальдегиде в течение 20 минут. Затем выполните две промывки в PBST по 5 минут каждая. Монтирование эмбрионов для визуализации начинается с двух 10-минутных инкубаций в 25% и 50% глицерине.
Затем поместите образцы в 75% glycerol и инкубируйте их в течение ночи при температуре four degrees Celsius. Этот этап ночного просветления облегчает препарирование эмбрионов. В завершение проведите препарирование и удалите желток из эмбрионов.
Для снижения фоновой флуоресценции закрепите эмбрионы плоским методом на предметном стекле и исследуйте их под микроскопом. На данных изображениях представлен отдельный конфокальный срез через задний конец эмбриона zebrafish на стадии 10 сомитов. Красное окрашивание показывает мРНК delta C, обнаруженную с помощью зонда, меченного дигоксигенином, и реагента TSA sci-fi.
Зеленое окрашивание соответствует обнаруженной с помощью зонда, меченного флуоресцеином, мРНК. При использовании реагента TSA-флуоресцеин ядра, окрашенные пропидиййодидом, имеют синий цвет в дважды окрашенном эмбрионе.
Можно однозначно определить области раздельной или перекрывающейся экспрессии. Данная процедура позволяет выявить субклеточную локализацию мРНК, что видно на этих детальных изображениях окрашивания. Активная транскрипция гена проявляется в виде точек окрашивания в ядре.
В других клетках наблюдается цитоплазматическая локализация мРНК. В эмбрионе с двойным окрашиванием можно увидеть клетки, в которых транскрибируются оба гена или любой из них.
Отдельно мы продемонстрировали, как проводить высокоразрешающую двойную флуоресцентную гибридизацию in situ целых эмбрионов zebrafish. При выполнении этой процедуры важно помнить, что сначала мы тестируем наши зонды с помощью стандартного окрашивания с применением щелочной фосфатазы; зонды, дающие чистый и сильный сигнал, будут эффективно работать и при флуоресцентной гибридизации in situ.
Мы также успешно использовали иммунолокализацию бета-катенина вместо окрашивания пропидийиодидом. При использовании данного варианта реакции гибридизации проводят при 55 °C вместо 65 °C. На этом всё.
Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол двойной флуоресцентной гибридизации in situ с высоким разрешением для анализа паттернов экспрессии генов в эмбрионах данио-рерио. Метод позволяет определить перекрытие доменов экспрессии двух генов с использованием ядерного контрастного окрашивания пропидиййодидом для улучшения визуализации организации тканей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология развития
- Анализ экспрессии генов
- Методы флуоресцентной визуализации
Теоретические сведения
- Метод гибридизации in situ на целых препаратах широко применяется в биологии развития.
- Данная методика позволяет визуализировать экспрессию генов в эмбрионах.
- Визуализация с высоким разрешением имеет решающее значение для понимания взаимодействий генов.
- Методы контрастного окрашивания повышают четкость структуры тканей.
Цель исследования
- Представить подробный протокол двойной флуоресцентной гибридизации in situ.
- Проанализировать паттерны экспрессии одиночных и перекрывающихся генов.
- Улучшить визуализацию распределения мРНК в эмбрионах zebrafish.
Используемые методы
- Гибридизация антисмысловых рибозондов с целевой мРНК.
- Использование антител, конъюгированных с пероксидазой, для детекции.
- Применение флуорофора, конъюгированного с арамидом, для визуализации.
- Отмывка несвязавшихся IDE для выявления субклеточного распределения мРНК.
Основные результаты
- Успешная визуализация паттернов экспрессии генов в эмбрионах zebrafish.
- Возможность сравнения экспрессии двух генов с использованием различных зондов.
- Визуализация с высоким разрешением позволяет выявить детальное субклеточное распределение.
- Подтвержденная эффективность протокола в лабораторных условиях.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод анализа экспрессии генов.
- Визуализация с высоким разрешением имеет принципиальное значение для исследований в области биологии развития.
- Перспективные области применения могут включать сравнительные исследования функций генов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Двойная флуоресцентная гибридизация in situ с высоким разрешением на модельных организмах zebrafish позволяет осуществлять точное пространственное картирование экспрессии генов, что способствует раннему поиску и валидации мишеней в моделях развития и заболеваний. Способность данного протокола разделять перекрывающиеся и обособленные домены экспрессии генов с субклеточным разрешением повышает достоверность прогнозов при анализе сигнальных путей и снижении рисков при изучении механизмов. Эта возможность имеет критическое значение для приоритизации портфеля исследований и продвижения трансляционных изысканий в системах позвоночных.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать перекрытие экспрессии генов и взаимосвязи сигнальных путей в интактных эмбрионах.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем выявления паттернов субклеточной локализации мРНК.
- Способствует снижению механистических рисков за счет пространственного анализа генов-кандидатов с высоким разрешением.
- Повышает прогностическую достоверность при приоритизации мишеней в сложных контекстах развития.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные модели Danio rerio для последующего скрининга функций и модуляции генов.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты визуализации для стандартизации анализа.
- Обеспечивает мультиплексное детектирование экспрессии генов, что поддерживает масштабируемые рабочие процессы скрининга.
- Предоставляет надежные данные для оценки влияния соединений на домены экспрессии генов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает согласованность картирования экспрессии генов с соответствующими моделями позвоночных при заболеваниях для непрерывности трансляционного переноса.
- Способствует поиску биомаркеров путем корреляции локализации mRNA с функциональными результатами.
- Облегчает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков за счет уточнения функции генов in vivo.
- Повышает прогностическую ценность при выборе и валидации доклинических моделей.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный протокол интегрирован в непрерывный процесс поиска новых лекарственных средств — от раннего тестирования гипотез до идентификации ведущих соединений и доклинической валидации — с использованием данио-рерио в качестве релевантной модели заболевания.
- Биология открытий: обеспечивает пространственные данные высокого разрешения для проверки гипотез и уточнения путей передачи сигналов.
- Скрининг: предоставляет количественные, воспроизводимые результаты визуализации для подготовки анализа.
- Аналитика: позволяет проводить прямое сравнение доменов экспрессии генов и их перекрытия с помощью конфокальной микроскопии.
- Трансляционные исследования: связывают этап открытий и доклинические исследования путем картирования экспрессии генов в целых эмбрионах позвоночных.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированный, многократно используемый рабочий процесс для анализа экспрессии генов в нескольких проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишени.
- Операционная ценность: стандартизирует визуализацию и анализ для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет раннего выявления биологических рисков.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритизацию с учетом рисков и продвижение активов на стадии поиска (discovery stage).
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с Danio rerio, разработки зондов и конфокальной микроскопии.
- Необходим доступ к флуоресцентной микроскопии и инфраструктуре для анализа изображений.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов валидации зондов и получения изображений.
- Адаптация к другим моделям позвоночных может потребовать оптимизации протокола.
- Специфичность сигнала и снижение фонового шума имеют решающее значение для достоверной интерпретации.
