Подготовка мозга крысы Совокупный культур для Нейрон и исследований Глия развития

Мы представляем систему для культивирования нейрональных прогениторов ЦНС в процессе их развития и дифференцировки в зрелые нейроны и глию. Процедура начинается с выделения четырех головного мозга плодов крыс на стадии E 16 и их переваривания с помощью пропана. Ткани переводят в суспензию из единичных клеток, фильтруют, подсчитывают и распределяют по шести.

Клетки в лунках планшета осторожно ресуспендируют один раз в день в течение двух-трех дней для обеспечения формирования агрегатов. Затем агрегаты собирают и просеивают через сетку с размером ячеек 200 µm, после чего путем промывки удаляют мелкие слипшиеся скопления и клеточный дебрис. В завершение агрегаты подсчитывают и высевают на покровные стекла, покрытые матригелем.

Здравствуйте, я Кото из лаборатории доктора Джона Л. кафедры интегрированных ветеринарных биологических наук Техасского университета A&M. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру создания культур мозговых агрегатов. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения эндоцитарной линии, развития клеток и ускоренных взаимодействий.

Итак, приступим. Перед началом работы подготовьте на столе стерильные инструменты, 70% ethanol, одноразовую пеленку для работы и чашки Петри диаметром 10 сантиметров для препарирования. Среду रखें на льду.

В вытяжном шкафу подготовьте диссекционный микроскоп с ледяной платформой и несколько чашек диаметром 10 сантиметров с диссекционной средой, также охлажденной на льду. В завершение приготовьте необходимые растворы и подогрейте среду для посева до 37 °C на водяной бане. Данный протокол начинается с получения эмбрионов крыс линии Sprague Dawley на 16-й день эмбрионального развития (E 16).

Сначала проведите эвтаназию беременной самки в соответствии с процедурой, утвержденной комитетом вашего учреждения по уходу и использованию животных. Положите эвтаназированную крысу на одноразовую пеленку и обработайте живот спиртом для очистки. Затем с помощью пинцета зажмите кожу в области живота и другой рукой ножницами сделайте разрез только кожи; раздвиньте края кожи и с помощью другого стерильного пинцета и ножниц рассеките мышечный слой.

Затем извлеките матку и перенесите ее в чашку диаметром 10 сантиметров с ледяной средой для диссекции. Следующий этап проводится в ламинарном шкафу с использованием микродиссекционных ножниц. Осторожно извлеките каждый эмбрион из матки.

Теперь пришло время приступить к сбору материала. Работайте с эмбриональным мозгом. Извлеките мозг из каждого эмбриона и поместите отделенные образцы в чистую чашку диаметром 10 сантиметров с диссекционной средой на ледяной платформе. Под диссекционным микроскопом завершите препарирование мозга.

Удалите отделы среднего и заднего мозга. С помощью тонкого пинцета удалите оболочки, затем перенесите оставшуюся часть переднего мозга в пробирку Falcon объемом 50 мл с dissecting medium. Теперь ткань готова к следующему этапу.

Диссоциация клеток путем ферментативного переваривания. Непосредственно перед началом переваривания приготовьте свежие растворы пропана и ингибитора трипсина с фильтрацией. Стерилизуйте их и подогрейте до 37 °C на водяной бане.

Удалите излишки среды из препарированного мозга. Затем добавьте четыре миллилитра подготовленного раствора для протеолиза пропан в пробирку объемом 50 миллилитров. Инкубируйте пробирку на водяной бане при температуре 37 °C ровно пять минут.

По истечении времени с помощью пипетки удалите раствор пропана. Затем добавьте 5 mL свежеприготовленного раствора ингибитора трипсина и поместите пробирку обратно в водяную баню при 37 °C еще на две-три минуты. По истечении времени удалите раствор ингибитора трипсина.

Повторите инкубацию с раствором ингибитора трипсина еще три раза. После последнего удаления раствора ингибитора трипсина добавьте в пробирку 20 milliliters подогретой среды для посева pm.

Теперь пришло время тритурировать и промыть клетки. Тритурируйте клетки с помощью 10 мл пипетки примерно 20–30 раз, пока не исчезнут все комочки. Затем центрифугируйте при 100 ×g в течение семи минут.

К этому моменту клетки должны быть хорошо отделены друг от друга. Через семь минут удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 10 мл среды для посева, чтобы промыть клетки.

Затем снова центрифугируйте их. Удалите супернатант и повторите промывку и центрифугирование. Состояние после второй промывки.

Ресуспендируйте осадок в 10 мл среды для культивирования агрегатов, затем пропустите клетки через клеточный сито с размером пор 70 мкм. В завершение подсчитайте количество живых клеток с помощью гемоцитометра.

Теперь вы готовы приступить к формированию агрегатов из диссоциированных клеток мозга. После подсчета суспендируйте диссоциированные клетки в среде для культивирования агрегатов до плотности 2 × 10⁶ клеток/мл. Перенесите по 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку немодифицированного 6-луночного планшета.

В течение трех ночей ежедневно осторожно ресуспендируйте клетки. При использовании дозатора P 1000 к дню посева агрегатов клетки начнут образовывать агрегаты. После того как клетки росли в течение трех ночей, снова осторожно ресуспендируйте их и пропустите суспензию через сетку с размером ячеек 200 µm в пробирку Falcon объемом 50 mL.

Дайте агрегатам осесть на дно пробирки в течение примерно трех-пяти минут. Затем осторожно удалите супернатант, добавьте среду, аккуратно ресуспендируйте агрегаты и снова дайте им осесть. Повторите эту процедуру несколько раз.

Для удаления мертвых клеток, одиночных клеток и клеточного дебриса используйте микроскоп, чтобы проверить, содержат ли супернатанты неагрегированные клетки и дебрис. После тщательной промывки агрегатов осторожно ресуспендируйте их в той же среде и подсчитайте количество агрегатов для определения их концентрации. Затем доведите плотность агрегатов примерно до 25–30 агрегатов на 50 µL.

Теперь пришло время высеять агрегаты на покровные стекла. Перенесите аликвоты по 1000 µL суспензии агрегатов в пробирки типа «эпендорф» объемом 2 мл; поскольку агрегаты имеют тенденцию оседать на дно пробирок, для посева крайне важно подготовить несколько пробирок с суспензией агрегатов. Покровные стекла, используемые на данном этапе, покрыты субстратом для клеточных культур Matrigel путем инкубации в течение ночи при 37 °C.

После приготовления аликвот суспензии агрегатов извлеките из инкубатора планшет с покровными стеклами, покрытыми Matrigel. Удалите раствор из каждой лунки. Промойте покровные стекла теплым PBS, а затем двойной дистиллированной H2O.

Теперь можно приступить к посеву агрегатов на покровные стекла. Переверните пробирку с суспензией агрегатов, чтобы перемешать содержимое и равномерно распределить агрегаты. Затем нанесите по 50 µL суспензии агрегатов в центр каждого покровного стекла.

Осторожно верните планшет в инкубатор, стараясь не тревожить его, чтобы агрегаты равномерно прикрепились к покровному стеклу. Плотность распределения агрегатов имеет решающее значение: если они расположены слишком близко друг к другу или если плотность посева высока, они склонны сливаться по мере роста через четыре-шесть часов после первоначального посева. Добавьте по 500 µL культуральной среды в каждую лунку.

Для поддержания культуры агрегатов каждые три-четыре дня заменяйте половину среды. При замене добавляйте среду вдоль стенки лунки, чтобы избежать разрушения агрегатов. Через несколько часов после прикрепления агрегатов к покровному стеклу можно наблюдать их разрастание.

Аксоны быстро растут в первые две недели и формируют многочисленные связи между агрегатами. Прогениторы Ggl мигрируют радиально из агрегатов и со временем дифференцируются в астроциты и зрелые олигодендроциты. Мы только что продемонстрировали вам способ культивирования агрегатов CS.

При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости правильного соблюдения емкости и равномерного перемешивания агрегата. На этом все.

Спасибо за просмотр и удачи в проведении вашего эксперимента.