Живая изображений Сотовые Ф-актина Динамика через Флуоресцентный Спекл микроскопия (FSM)

Флуоресцентная спекл-микроскопия используется для зондирования динамики различных белков цитоскелета в живых клетках. При правильном использовании можно проводить количественные измерения скорости и кинетики оборота белков цитоскелета. Мы начинаем эту процедуру с микровведения небольшого объема флуоресцентно меченного актона в живые клетки.

Затем мы собираем камеру для визуализации, чтобы уменьшить последствия фотообесцвечивания. Первые два куска двустороннего скотча размещаются с обеих сторон микрослайда, где будет лежать слип крышки нашей ячейки. Затем носители для визуализации пипетируются в камеру путем дозирования среды рядом с одной из открытых щелей.

Наконец, все четыре стороны запечатываются камердинером. Здравствуйте, меня зовут Джеймс Лим и я работаю в лаборатории Дьюцера Галдена на кафедре клеточной биологии в Научно-исследовательском институте Скриппса. Сегодня мы покажем вам процедуру флуоресцентной спекл-микроскопии.

Мы используем эту процедуру для исследования динамики актонов в мигрирующих эпителиальных клетках. Итак, приступим. Ключевым компонентом для получения хороших фильмов флуоресцентной спекл-микроскопии является правильная маркировка актона С флюорочетверкой по вашему выбору мы рекомендуем использовать флюорочетверки Alexa и X rodine cin, производные средней эстеры, которые нацелены на открытые остатки лизина на поверхности актона.

Важно, чтобы коэффициент мечения был высоким, от 0,3 до 0,7 красителей на мономер актона, чтобы гарантировать, что пятнышки будут выглядеть яркими и незаметными перед длительным хранением. Уточните меченый раствор Актона путем центрифугирования при температуре от 75 000 до 80 000 раз G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Меченый Актон следует хранить в буферном растворе G при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Готовят два микролитра аликвот во избежание многократного замораживания размораживания, которое может привести к образованию нерастворимых агрегатов. Чтобы избежать фотообесцвечивания цветочных четверок, не подвергайте маркированный раствор актина воздействию прямого света в течение длительного периода времени и используйте непрозрачные микроцентрифужные пробирки для длительного хранения. Ячейки для микроинъекций на промывку кислотой промываются квадратным стеклом накрытыми стеклами.

Стандартное покрытие подложки может быть нанесено на покровное стекло и не повлияет на микровпрыск. Храните клетки при температуре 37 градусов во время подготовки актина для отбора клеток, которые поддаются микроинъекции. Для FSM учитывайте эти критерии.

Ячейки должны быть большими, более 50 мкм в диаметре, должны быть плоскими, покрытыми одним покрытием и естественно прилегать к субстратам. Также полезно, если изол участка клетки занимает площадь большую, чем площадь ее ядра. Некоторые подходящие клеточные линии включают PTK one, клетки легких тритона и нейроны AIA.

В этой демонстрации мы будем вводить ПТК в эпителиальные клетки. Правильный выбор игл для микроинъекций зависит от размера отверстия кончика. Как правило, размеры отверстий могут варьироваться от 0,5 микрометров до трех микрометров.

Мы рекомендуем оптимальный размер отверстия от 0,5 до одного микрометра. Для инъекций Acton микроинъекционные иглы могут быть как приобретены, так и изготовлены. Если для начинающих доступен коммерческий иглосъемник, мы рекомендуем иметь под рукой от 10 до 20 вытягивающих игл перед началом процедуры инъекции.

Следующим шагом является разбавление меченого актона ледяным инъекционным буфером. Держите все рабочие растворы на льду. Идеальная концентрация при инъекции, которая представляет собой конечную концентрацию актона, загруженного в иглу, составляет от 0,5 до одного микрограмма на микролитр.

Исходя из 40%-ного отношения мечения D к мономеру актина, загрузите 0,5 к одному микролитру разбавленного раствора актина. С помощью микроиглы шприца осторожно дозируйте раствор актона. Старайтесь избегать образования пузырей.

Если пузырьки есть, их можно легко удалить, впитав лишнюю жидкость вокруг пузыря. Убедитесь, что раствор Актона полностью упирается в кончик иглы. Избыток раствора не должен быть нигде вдоль капилляра иглы, потому что он может нарушить поток инъекции.

Теперь загруженная игла готова к прикреплению к держателю для инъекций для микроинъекций. Достаньте клетки из инкубатора и положите крышку на предметный столик микроскопа. Чтобы начать процедуру микроинъекции, поднесите заряженную иглу к микроскопу.

Осторожно приложите иглу к держателю инжектора, избегая контакта кончика иглы. Расположите держатель так, чтобы игла делала угол от 35 до 50 градусов к основанию предметного столика микроскопа. Опустите кончик иглы до тех пор, пока он едва не пробьет поверхность среды для купания.

Теперь ваши клетки расположили кончик иглы так, чтобы он находился прямо над центром объектива. Если кончик иглы выровнен с объективом, через окуляр должен быть виден яркий ореол. Это конец кончика иглы.

Медленное перемещение иглы из стороны в сторону может помочь лучше локализовать ореол. При навигации убедитесь, что кончик иглы находится значительно выше клеток. Чтобы предотвратить поломку кончика иглы, отрегулируйте Z.Focus на микроскопе так, чтобы клетки оказались в поле зрения.

Затем медленно опускайте кончик иглы, контролируя фокус, пока ореол постепенно не сужается и, наконец, не сойдется в кончике иглы. Также можно поискать стержень иглы, который будет отбрасывать линейные тени. Опускание иглы будет постепенно определять стержень иглы.

Для улучшения контраста может потребоваться небольшая регулировка фазового кольца: теперь конец иглы и ваши клетки должны быть хорошо видны. При выборе клеток для введения клетки со свободными краями должны быть обращены к кончику иглы. Это гарантирует, что наклон клетки от самой толстой точки, где находится ядро, до самой тонкой точки переднего края, будет встречаться с кончиком иглы, а не идти параллельно ей.

Установите давление иглы на 0,3–0,8 фунта на квадратный дюйм. Постоянное давление приведет к равномерному потоку раствора актона. Когда вы определитесь с клеткой для инъекции, расположите иглу так, чтобы кончик находился рядом с ядром клетки, медленно опустите и отрегулируйте положение иглы до тех пор, пока кончик не начнет нажиматься.

Мембрану постепенно опускайте иглу до тех пор, пока ее кончик не проткнет мембрану. Если игла полностью проколола мембрану, клетка будет казаться ярче. Как только вы увидите это изменение, поднимите иглу до тех пор, пока она больше не будет касаться клетки.

Сам процесс прокалывания и инъекции займет от 0,5 до двух секунд. При правильном выполнении форма ячейки будет отображаться без изменений. Чтобы свести к минимуму нагрузку на клетки, уделяйте не более 20 – 45 минут на каждый сеанс микроинъекций.

Иногда при инъекции вы можете не заметить изменений в клетке и клетка не становится ярче. Это указывает на то, что кончик иглы может быть закрыт. Вы можете проверить это, нажав кнопку очистки, если таковая имеется на вашем транс-инжекторе.

Если кончик иглы открыт, это значительно увеличит постоянный поток давления, который может быть виден в виде ряби и рассеивания близлежащего мусора. Если кончик иглы закрыт, вы можете либо вставить новую иглу для микроинъекций, либо попытаться сломать кончик иглы, осторожно опуская иглу до тех пор, пока кончик иглы не прижмется к стеклопакету крышки. Тем самым из-за чего сломается самый конец наконечника.

Площадь разрыва должна составлять не более одной пятой площади точки иглы, той части иглы, которая начинает сходиться, до точки, когда микроинъекция завершена. Замените клеточную среду в чашке на свежую предварительно подогретую среду, чтобы удалить любые флуоресцентные остатки. После смены среды дайте клеткам восстановиться в течение 30 минут в инкубаторе с температурой 37 градусов перед визуализацией.

Это также позволит актину интегрироваться в существующую сеть цитоскелета, пока клетки восстанавливаются в инкубаторе, начинают сборку камеры визуализации. Сначала подогрейте носители изображения на водяной бане с температурой 37 градусов. Далее разморозьте, 15 микролитров аликвоты оксы стереть при комнатной температуре.

Добавление РА в среду в дальнейшем значительно снизит эффекты фотообесцвечивания. Если обернуть окса-стиратель в алюминиевую фольгу, это обеспечит защиту фоточувствительного состава от света. Предварительно нагрейте герметик VAP на горячей плите, которая установлена на низкую температуру, не перегревайте и не сжигайте пар, иначе он потеряет свою эффективность в качестве герметика.

Протрите микрогорку салфеткой Кима, смоченной чистым этанолом, чтобы очистить и удалить мелкий мусор. Сложите два равных по размеру двустороннего скотча длиной 2,5 сантиметра друг на друга, используя чистую плоскую поверхность, например, еще одну микрогорку. В качестве платформы выдавите все захваченные пузырьки воздуха, чтобы создать абсолютно плоскую плоскость.

Далее с помощью лезвия бритвы разрежьте две прямые полоски вдоль длинной оси ленты так, чтобы каждая полоска имела ширину 0,5 сантиметра. С помощью щипцов поместите каждую полоску вдоль длинных краев микропредметного стекла так, чтобы две полоски ленты образовали зазор в центре микропредметного стекла. Аккуратно надавите на ленту, чтобы получилось красивое уплотнение со стеклом.

Эти полоски ленты будут действовать как прокладки между микрослайдом и накладкой. Проверьте клапан, чтобы убедиться, что он полностью разжижается. Прежде чем приступить к следующему шагу, извлеките предварительно прогретый носитель изображения.

Добавьте 15 микролитров кислородных лучей на каждые 500 микролитров среды. Сложите салфетку в треугольник, чтобы получилось три жестких края. Это будет использовано для последующего протирания защитного чехла.

Извлеките клетки из инкубатора с помощью щипцов. Быстро поднимите уголок чехла. Поместите защитный лист на салфетку Кима стороной клетки вверх и не касаясь ткани, и используйте сложенную салфетку Кима, чтобы протереть две противоположные стороны защитного стекла, чтобы создать полусухую поверхность.

Затем подхватите щипцами уголок покровного стекла и поместите покровный лист на микрослайд так, чтобы сухие поверхности были выровнены по двум полоскам ленты. Обратите внимание, что теперь у вас есть две закрытые стороны и две открытые щели. Медленно пипетируйте 200 микролитров раствора RA носителя для визуализации рядом с одним отверстием.

Важно не вводить пузырьки воздуха. Раствор следует всасывать во вновь собранную камеру с помощью капиллярных сил, тем самым полностью погружая ваши клетки в раствор. С помощью ватной палочки промокните четыре угла чехла расплавленным паром, чтобы быстро закрепить и стабилизировать чехол

Вы заметите, что VAP высыхает в течение нескольких секунд при комнатной температуре. Затем, начиная с закрытых сторон, нанесите тонкую полоску ВАП, используя ватный тампон и имитируя мазок кистью. Повторите то же самое для открытых сторон.

Медленно наращивайте слой пара, укрепляя уплотнение, повторяя этапы нанесения покрытия. VAP должен быть ограничен краями, оставляя центр защитного стекла свободным. После того, как края защитного стекла будут запечатаны, аккуратно очистите центральную часть защитного стекла с помощью ватной палочки с DD H2O для удаления остатков среды.

Будьте осторожны, чтобы не раздавить клетки. Повторите этот этап очистки с чистым этанолом. Теперь у вас есть полностью закрытая камера визуализации, оптимизированная для флуоресцентной спекл-визуализации.

Наличие полностью герметичного корпуса предотвратит быстрое фотообесцвечивание ваших цветочных четверок. Теперь клетки в полностью закрытой камере готовы к визуализации. Мы используем инвертированный широкоугольный микроскоп с ртутной лампой, эпиосветителем, соответствующими фильтрами и планом погружения в масло.

Изображения апохроматических объективов захватываются с помощью охлаждаемой ПЗС-камеры с пикселями 6,7 микрон и программного обеспечения для получения изображений. Разогрейте предметный столик микроскопа до 37 градусов. Установите камеру визуализации и подождите от 10 до 15 минут, пока температура стабилизируется, прежде чем делать визуализацию.

Как только температура стабилизируется, сфокусируйте клетки в светлом поле, а затем найдите введенные клетки, переключив правильные настройки флуоресценции. Постарайтесь свести к минимуму время флуоресцентного воздействия, чтобы уменьшить фотообесцвечивание. Ищите введенные клетки со здоровыми, изогнутыми передними краями.

Чрезмерно введенные клетки будут характеризоваться втянутыми и зазубренными краями, напоминающими многочисленные филоподии. Не визуализируйте эти клетки. Настройки сбора данных будут зависеть от типа клеток, качества маркированного актона и компонентов микроскопа.

Однако настройки экспозиции не должны превышать двух секунд, а интервал времени между кадрами должен быть установлен в диапазоне от пяти до 10 секунд. Настройки усиления на камере можно увеличить, чтобы увеличить соотношение сигнала к шуму. Идеальные характеристики спекла должны иметь расстояние между каждым спеклом примерно на два диаметра до следующего соседнего спекла.

Для эпителиальных клеток крапчатая актиновая сеть будет казаться однородной. С крапинками равномерно расправляем. Настройки экспозиции должны быть отрегулированы, чтобы получить наилучшие пятнистые изображения.

Ключом к получению хороших спекл-пленок является удержание концентрации. Это особенно важно для последующего анализа, включающего измерения зернистого потока и оборота. Таким образом, качество количественного анализа будет зависеть от фиксации фокуса на протяжении всего временного интервала.

Различные стратегии поддержания фокусировки подробно описаны в тексте для этой демонстрации с использованием системы фокусировки Nikon Perfect. Вот различные примеры микроинъекционных клеток. На левой панели показана микроинъекционная ячейка с изображением спекла с низкой концентрацией.

На средней панели показана сверхмикроинжектированная ячейка со слишком высокой концентрацией, а на правой панели показана оптимально введенная ячейка. Для ФШМ с хорошим спекл-изображением. Нам только что показали вам, как вводить флуоресцентно меченный актон в эпителиальные клетки для флуоресцентной спекл-микроскопии.

При выполнении этой процедуры чрезвычайно важно помнить, что качество вашего меченого актона, а также техника микроинъекции будут определять общее качество ваших спекл-изображений. Вот и все, и удачи в ваших экспериментах.