Name: Живая изображений Сотовые Ф-актина Динамика через Флуоресцентный Спекл микроскопия (FSM) (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 16 s
Description: Узнайте метод флуоресцентной спекл-микроскопии для изучения динамики цитоскелетных белков в живых клетках. Демонстрируется микроинъекция меченого актина и сборка камеры для минимизации фотобликирования.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Развитие qFSM финансируется за счет гранта NIH U01 GM06230.

<ol><li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy+%28FSM%29+of+microtubules+and+actin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li>
<li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li>
<li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li>
</ol>

Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Несколько ключевых факторов имеют решающее значение для успешного получения спекл-изображений, каким бы хорошим крапинками начинаться и заканчиваться качество вашей флуоресцентно меченных актина. Высокий коэффициент маркировке красителей с актином мономера, расположенные вокруг 0,4 до 0,7 будет гарантировать, что крапинками появятся яркие и дискретно, в то время как меченого белка сама по себе должна быть растворимы и без агрегатов. Не менее важным является микроинъекции процедуры. Для обеспечения нормального гомеостаза...

Инъекция буфера (IB) 50 мМ глутамат калия 0,5 M MgCl2 (ПРИЛОЖЕНИЕ 2А) Храните до 2 лет при температуре -20 ° C &nbsp; G-буфера 2 мМ Трис ⋅ Cl, рН 8,0 (ПРИЛОЖЕНИЕ 2А) 0,2 мМ CaCl2 (ПРИЛОЖЕНИЕ 2А) Добавить непосредственно перед употреблением: 0,2 мМ АТФ (см. рецепт 100 мМ) 0,5 мМ 2-меркаптоэтанол Храните до 1 дня при 4 ° С

Живая изображений Сотовые Ф-актина Динамика через Флуоресцентный Спекл микроскопия (fsm)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

В этом протоколе описываются использование флуоресцентных Спекл микроскопия (FSM) для захвата изображений с высоким разрешением актина динамика в PtK1 клеток. Уникальное преимущество автомата является ее возможность захвата движения и оборот кинетики (сборка / разборка) из F-актин сети в живых клетках. Эта методика особенно полезна при выводе количественных измерений F-актин динамика в паре с компьютерного зрения программного обеспечения (qFSM). Мы описываем отбора, микроинъекции и визуализации флуоресцентных зондов актина в живых клетках. Важно отметить, что аналогичные процедуры, применимые к визуализации других сборок macomolecular. FSM был продемонстрирован на микротрубочки, промежуточные нити, и адгезию комплексов.

Выбор, микроинъекции, и обработки изображений флуоресцентно меченных F-актин с помощью флуоресцентной микроскопии спекл (ФШМ).

Живая изображений Сотовые Ф-актина Динамика через Флуоресцентный Спекл микроскопия (FSM)

В данном протоколе мы описываем использование флуоресцентной спекл-микроскопии (FSM) для получения изображений динамики актина в клетках PtK1 с высоким разрешением. Уникальный ...

live-cell-imaging-f-actin-dynamics-via-fluorescent-speckle-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Целью данного документа является указание читателя в работе интегрированной атомно-силовой микроскоп-оптических изображений для механической стимуляции живых клеток в культуре. Шаг за шагом протокол представлен. Набор репрезентативных данных показывает жить клеточного ответа на механическое раздражение представлена.

Живая клеточного ответа на механическое раздражение Учился по комплексному Оптические и атомно-силовой микроскопии

Микроскопические изображения живых эндотелиальных клеток, экспрессирующих GFP-актин позволяет характеристике динамических изменений цитоскелета структур. В отличие от методов, которые используют фиксированных экземпляров, этот метод обеспечивает детальную оценку временных изменений в актина цитоскелета в тех же камерах до, во время и после различных физических, фармакологических, или воспалительные стимулы.

Изучение актинового цитоскелета в клетках эндотелия Живая выражая GFP-актин

Пространственно-временная информация о динамических белках внутри живых клеток имеет решающее значение для понимания биологии. Разновидность микроскопии сверхвысокого разрешения, называемая быстрой 3D-структурированной световой микроскопией (f3D-SIM), позволяет получить уникальную информацию о цитокинетическом Z-кольце у бактерий: как о его похожем на шарики, так и о быстрой динамике FtsZ внутри кольца.

Супер-Resolution Imaging из Cytokinetic Z Кольцо в живых бактерий Использование быстрого 3D-Structured Illumination микроскопии (F3D-SIM)

Пространственное распределение и временная динамика белков и липидов плазматических мембран является актуальной темой в биологии. Здесь эта проблема решается с помощью пространственно-временного анализа флуктуаций изображения, который обеспечивает концептуально те же физические величины отслеживания отдельных частиц, но использует малые молекулярные метки и стандартные микроскопические установки.

От быстрого флуоресценции визуализации к молекулярной диффузии Закона о живых клеточных мембран в торговом микроскоп

Для исследования скоростей потока и направленности нитевидного актина в иммунологическом синапсе Т-клеток, визуализация живых клеток сверхвысокого разрешения сочетается с флуоресценцией полного внутреннего отражения и количественно оценивается с помощью спектроскопии пространственно-временного корреляционного изображения.

Корковая актин расхода в Т-клетках количественно пространственно-временной корреляционной спектроскопии Изображение структурированных данных микроскопии Освещение

Мы представляем протокол для применения интерферометрических фотоактивированного локализации микроскопии (iPALM), 3-х мерной локализации одной молекулы методом микроскопии сверхвысокого разрешения, к визуализации актинового цитоскелета в прикрепленных клетках млекопитающих. Такой подход позволяет на основе света визуализации наноразмерных структурных особенностей, которые в противном случае остаются нерешенными обычными дифракционной оптической микроскопии.

Трехмерная Суперразрешение Микроскопия F-актин филаментов интерферометрической фотоактивированного локализации микроскопии (iPALM)

Этот протокол описывает новый метод, позволяющий для количественного визуализации сложных формирования SNARE белков, основанный на передачи энергии резонанса Фёрстер и флуоресценции жизни изображений микроскопии.

Визуализация внутриклеточных SNARE людьми флуоресценции жизни изображений микроскопия

Мы опишем, как микро - и добавлены методы, такие как FRAP и photoactivation включить определение параметров подвижности и пространственно-временных динамики белков внутри миграции клеток. Экспериментальная отсчетов включают субцеллюлярные динамика и оборот регуляторов подвижности или базовой Цитоскелет актина.

Микроманипуляции методы, позволяя анализ морфогенетических динамики и оборот цитоскелета регуляторов

Чтобы продвинуться вперед, конусы роста должны оказывать тяговые силы против внешней среды. Генерация тяговых сил зависит от динамики актина и сцепления сцепления. В настоящем исследовании описаны методы анализа динамики актина, сцепления сцепления и тяговых сил для продвижения конуса роста.

Анализ динамики актина, сцепления сцепления и тяговой силы для продвижения конуса роста

Мы представляем протоколы для простых микрофлюидных анализов актиновой нити в сочетании с флуоресцентной микроскопией, которые позволяют точно контролировать отдельные актиновые нити в режиме реального времени, последовательно подвергая их воздействию различных белковых растворов.

Использование микрофлюидики и флуоресцентной микроскопии для изучения динамики сборки одноактиновых нитей и пучков

Здесь мы представляем методы получения квазидвумерных (2D) запутанных, сшитых и жидкокристаллических актиновых сборок из очищенных белков.

Настройка режимов сократимости и деформации активных сборок на основе актина in vitro: от двумерных активных сетей до жидкокристаллических капель

Узнайте метод флуоресцентной спекл-микроскопии для изучения динамики цитоскелетных белков в живых клетках. Демонстрируется микроинъекция меченого актина и сборка камеры для минимизации фотобликирования.

Живая изображений Сотовые Ф-актина Динамика через Флуоресцентный Спекл микроскопия (FSM)

Больше видео