Фактор Роста покрытием из бисера Размещение на Спинной эксплантов переднего мозга

Это первый тип гранул, которые я буду использовать. Это синие гелевые гранулы. Они мягкие.

Таким образом, мне потребуется использовать стеклянную пипетку с закругленным концом, прикрепленную к ротовой пипетке, чтобы поместить эти бусины на Xs. Второй тип бусин, который я продемонстрирую, — это гепарин-акриловые бусины. Это жесткие бусины, и я буду помещать их на экспланты X с помощью вольфрамовой иглы. Перед этим я расплавлю с помощью горелки Бунзена данные стеклянные капиллярные трубки.

Затем я вытяну их, чтобы создать более тонкий кончик. Для этого я держу капиллярную трубку в центре пламени и вращаю её по мере плавления. Я чувствую, как трубка размягчается.

Я вынимаю трубку из пламени и вытягиваю её. Теперь я процарапаю линию поперек капиллярной трубки этим пером с алмазным наконечником, чтобы получить ровный срез. Затем я проведу оплавление концов для их очистки.

Я проведу капилляр через пламя, чтобы зашлифовать конец и сузить отверстие, чтобы он мог захватить бусину, а не пропустить её сквозь себя. Важно отметить, что капиллярную трубку не следует долго удерживать в пламени. Это должно быть очень быстрое движение, иначе отверстие затянется.

Обычно я изготавливаю несколько таких изделий, так как во многих из них кончик оказывается запаянным из-за воздействия пламени. Этим процессом трудно управлять, поэтому приходится делать несколько заготовок. Перед вами пример образца с запаянным кончиком.

Это пример использования качественного дозатора. Я перенесла 250 µL агарозных бусин в эту пробирку типа «эппендорф» и теперь собираюсь промыть их пять раз с использованием 1 mL PBS, чтобы удалить раствор AZI, в котором они находились. Я подожду около трех минут, чтобы бусины осели, затем аспирирую излишки PBS и повторю эту процедуру еще четыре раза.

Гранулы еще не успели полностью осесть; когда они осядут, я аспирирую избыток PBS и повторю эту процедуру четыре раза. В конце я добавлю 300 µL PBS и приступлю к работе с гранулами. Это стандартная ротовая пипетка, я возьму подготовленный капилляр и введу его примерно на одну треть ее длины.

Сначала заполните пипетки раствором PBS. Обычно заполнение происходит за счет капиллярного эффекта. Перед нами крышка от 30-миллиметровой культуральной чашки, на которую я поместил каплю синих бусин.

Рядом с ней находится маленькая капля PBS. А в этой лунке находится капля белкового раствора объемом 5 µL. В данном случае это B and P four, но с помощью дозатора можно использовать любой выбранный вами белок.

Я перенесу бусину из этого синего круга, однократно промою ее в капле PBS. Затем с помощью ротового дозатора я возьму бусину, помещу ее в каплю белкового раствора и проинкубирую либо при комнатной температуре в течение примерно одного часа, либо при 4 °C в течение нескольких часов. Таким образом, перед вами пул бусин в PBS, и мне необходимо отобрать бусины подходящего размера.

Если они будут слишком малы, они просто пройдут сквозь ротовую пипетку. Они должны просто остаться на конце. Таким образом, теперь вы видите, что я выбрал несколько бусин: три более крупных и три более мелких.

В эксперименте я буду использовать более крупные бусины. Сейчас я перенесу одну крупную бусину из капли PBS в каплю раствора белка. Для этого я осторожно оттяну язык от ротовой пипетки.

Это не всасывающее движение, а просто создание отрицательного давления. Затем я перенесу его и фактически снова прижму язык к отверстию. Головка трубки — не выдувание, а просто создание положительного давления, чтобы вытолкнуть бусину с конца.

Теперь в капле раствора белка находятся пять бусин; я буду инкубировать их при температуре 4 °C в течение нескольких часов или, как вариант, при комнатной температуре от получаса до одного часа. Перед нами чашка Петри с мембраной, плавающей в среде вместе с уже препарированными эксплантами. С помощью наконечника пипетки я сейчас заберу часть среды.

Я промою гранулы в капле среды всего один раз непосредственно перед тем, как поместить гранулу на плоскость X. Это вольфрамовые иглы, которые я буду использовать для захвата и размещения акриловых гранул. Вот вольфрамовая игла, сейчас она находится в своем держателе.

И вот отличные пинцеты под углом 45 градусов. Я буду использовать вольфрамовую иглу в пинцете, чтобы поднять бусину из этого объема PBS и перенести ее в каплю белкового раствора.

Как я сделал с гелевыми бусинами. Подобно гелевым бусинам, я пять раз промыл эти акриловые бусины в PBS и перенес каплю на этот планшет. Затем я использую вольфрамовую иглу в пинцете, чтобы перенести бусину в каплю белка и инкубировать её точно так же, как я делал с гелевыми бусинами.

Таким образом, осуществляется подъем микросферы. Я плотно прижимаю правую руку к столу, а левым указательным пальцем фиксирую иглу при погружении в жидкость; я слегка касаюсь микросферы иглой и медленно поднимаю ее из жидкости. Иногда микросфера соскальзывает с иглы, в таком случае следует просто повторить процедуру для другой микросферы.

Теперь в левой руке я держу пинцет под углом 45 градусов. Опустив кончики вниз, я касаюсь ими бусины и иглы в жидкости. Используйте кончик пинцета, чтобы аккуратно сдвинуть ее.

Теперь у меня пять бусин с белком. Итак, в правой руке я держу вольфрамовую иглу в бусине, а в левой — снова пинцет концом вниз, точно так же, как я сбрасывал четыре предыдущие; я повторю это здесь на примере. Инкубируйте при 37 °C, время зависит от конкретного анализа.