Экстракции ДНК из 0,22 мкм Фильтры Sterivex и цезия хлорид центрифугирования в градиенте плотности

Привет, я Джоди из лаборатории, Стивен Халлам с кафедры микробиологии в иммунологии Университета Британской Колумбии. Сегодня мы покажем вам процедуру извлечения геномной ДНК, сконцентрированной из образцов морской воды на фильтрах STX толщиной 0,2 микрона, и очистку этой ДНК центрифугированием с помощью градиентного центрифугирования хлорида цезия. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для получения ДНК окружающей среды, чтобы мы могли изучать структуру, разнообразие и метаболизм микробных сообществ в морской среде.

Итак, приступим. Начните этот протокол с размораживания на льду смеси Х-фильтров, которые вы предварительно сконцентрировали с планктонной биомассой, обработали лизисом, буфером и заморозили для простоты. Здесь мы опишем порядок обработки индивидуального фильтра.

На практике мы рекомендуем обрабатывать 15 или менее фильтров за один раз. Как только фильтр оттает, приступайте к первой из двух инкубаций. Один для лизирования клеток и удаления РНК, а другой для расщепления белков.

Для первой инкубации добавьте в фильтр 100 микролитров лизоцима, и 20 микролитров RN a's a. Закройте фильтр парфюмом и оставьте его вращаться при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа. Для следующей инкубации добавьте в фильтр 100 микролитров белка ace KN 100 микролитров 20% SDS.

Загерметизируйте фильтр с помощью perfil и оставьте его вращаться еще на один-два часа. На этот раз при 55 градусах. С помощью шприца объемом пять куб. см переведите лизат из фильтра Stax в 15-миллилитровую пробирку для сокола.

Промойте фильтр одним миллилитром буфера для лизиса и добавьте жидкость для промывки в лизат в пробирке falcon. Теперь, когда вы лизировали и переварили свои клетки, вы готовы извлечь их ДНК. Следующим шагом является использование метода фенолхлороформа для извлечения ДНК из лизата.

Добавьте в лизатный трубчатый вихрь примерно три миллилитра фенола, хлороформа, изоамилового спирта. В течение 10 секунд хорошо перемешать, закрутить трубку при 2,500 G в течение пяти минут. Во время центрифугирования смесь лизата фенолхлороформа должна разделиться на два слоя.

Органический слой на дне, содержащий фенолхлороформ и белки из образца. И водный слой, как правило, сверху, который состоит из вашей ДНК, воды и других более гидрофильных молекул. Перенесите водный слой, содержащий вашу ДНК, в новую 15-миллилитровую пробирку Falcon К этой пробирке добавьте равный объем смеси хлороформа изоамилового спирта в вихревом состоянии на 10 секунд.

На этом этапе из образца ДНК удаляются остатки фенола. Вращайте его в 2,500 раз G в течение пяти минут или пока водный слой не станет прозрачным. Переложите водный слой в новую пробирку с маркировкой и добавьте один миллилитр TE при PH восемь.

Теперь у вас есть экстракт ДНК. Следующим шагом является промывка и концентрирование образца ДНК в ультрацентрифужной пробирке Amazon объемом 15 миллилитров. Перенесите образец ДНК в отсек фильтра анона.

Ультратрубки состоят из фильтра, который удерживает молекулы на уровне или выше заданной молекулярной массы, тата и трубки для улавливания потока через фильтрат. В этом случае фильтр сохраняет спин вашей ДНК при 3500 G в течение 10 минут. Убедитесь, что в фильтре Amon осталось менее одного миллилитра жидкости.

Если осталось больше ретен Тейт, залейте фильтр TE и снова открутите. Удалите поток или отфильтруйте его в другую пробирку и храните ее в холодильнике до тех пор, пока вы не подтвердите свой конечный продукт на геле, добавьте два миллилитра TE буфера в фильтр Amazon и крутите при 3500 перегрузках в течение шести минут. Удалите фильтрат, как и раньше.

Промывайте ДНК еще дважды TE в общей сложности за три промывки, сохраняя фильтрат каждый раз для последнего отжима промывки до тех пор, пока в фильтре Amon не останется от 200 до 500 микролитров Tate. Запишите окончательный объем и переложите в промаркированный тюбик эйнора объемом 1,5 миллилитров. Изготовьте аликвоту 70 микролитров промытой концентрированной ДНК для использования в качестве рабочего материала.

Храните рабочий состав при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Заморозьте остальную часть ДНК при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Проверьте концентрацию ДНК и качество конечного продукта, запустив образцы в геле рядом с ДНК.

Лестницы, которые служат стандартами размера и интенсивности, устанавливают 0,8% гель AROS плюс бромид атерия для работы в течение ночи. На первых нескольких полосах загрузки лестниц с лентами различной молекулярной массы и концентрации мы рекомендуем следующую схему загрузки. На первых двух полосах загрузите 10 микролитров по одному килобайту плюс лестница на следующих трех полосах, загрузите две микролитра, пять микролитров и 10 микролитров соответственно по 50 нанограммов на микролитр Lambda H три лестницы.

Наконец, загрузите пять микролитров на каждую дорожку образца экстракта ДНК. Запустите гель при напряжении 15 вольт в течение примерно 16 часов. Сфотографируйте гель с помощью системы документирования УФ-геля, чтобы определить диапазон молекулярных масс вашей ДНК и ее концентрацию.

Сравните полосы образца с полосами лестницы. ДНК хорошего качества будет иметь высокую молекулярную массу и демонстрировать мало признаков сдвига или деградации. Если качество ДНК хорошее, а количество достаточное, приступайте к очистке ДНК, выполняя градиент хлорида цезия.

Центрифугирование первой маркировкой, по одной центрифужной пробирке для каждого образца в каждую центрифужную пробирку, добавить 160 миллиграмм хлорида цезия и 178 микролитров геномной ДНК. Накройте трубку небольшим кусочком перфила и аккуратно переверните трубку от 10 до 20 раз, чтобы смешать компоненты. Не смешивайте пипетированием, так как это может привести к сдвигу ДНК.

Затем добавьте в тюбик 10 микролитров бромида AUM и снова перемешайте. Перед центрифугированием убедитесь, что пробирки хорошо сбалансированы и что разница в весе между пробирками составляет менее одного миллиграмма. Поместите пробирки в ротор ультрацентрифуги с помощью пинцета.

Затем закройте крышку ротора и поместите ротор внутрь ультрацентрифуги вплотную. Вакуум для ультрацентрифуги будет применен, как только вы закроете дверцу. Работайте в течение ночи в общей сложности 18 часов при 100 000 об/мин при 20 градусах Цельсия.

Когда центрифугирование будет завершено, извлеките пробирки из ротора с помощью пинцетных ножниц и поместите на стойку. Поднесите трубки к транслюминатору синего света, наденьте очки с янтарным фильтром. Затем включите синий свет и посмотрите на полосу ДНК с помощью стерильного шприца объемом в один кубический сантиметр и иглы.

Снимите полосу ДНК, а затем поместите ее в 1,5-миллилитровую эйноровую пробирку, чтобы восстановить большую часть ДНК, попавшей в мертвое пространство шприца. Промойте шприц 100 микролитрами te и добавьте раствор для полоскания в тюбик. Приготовьте одну пробирку с 100 микролитрами буфера на образец, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.

Чтобы удалить бромид АУМ из ДНК, добавьте в пробирку равный объем насыщенного водой бутанола. Осторожно переверните пробирки, от 10 до 20 раз центрифугируйте при 10 000 об/мин в течение одной минуты и выбросьте верхний слой. Повторите стирку еще три-четыре раза, пока цвет бутанола не станет прозрачным.

Поместите четыре миллилитра TE в ультрацентрифужную пробирку и добавьте раствор ДНК из центрифуги в 3500 раз больше G при комнатной температуре, пока объем ДНК не уменьшится примерно до 100-500 микролитров, и отбросьте поток. Добавьте два миллилитра TE в фильтр Amazon и центрифугируйте при 3500-кратном G в течение шести минут. Повторите дважды для получения в общей сложности трех промывок концентратом до конечного объема от 50 до 100 микролитров путем дополнительного центрифугирования по мере необходимости.

И перенести раствор ДНК на фильтре в новую 1,5-миллилитровую эйноровую трубку. Добавьте 40 микролитров te в теонный фильтр и проводите пипеткой вверх и вниз по обеим фильтрующим мембранам, чтобы смыть остатки ДНК. Добавьте этот раствор в пробирку с концентрированной ДНК.

Поместите фильтрующий блок MicroCon YM 30 в трубку MicroCon и предварительно промойте MicroCon, добавив 200 микролитров автоклавной воды и центрифугируя при 10 000 об/мин в течение семи минут. Добавьте раствор ДНК в предварительно промытый MicroCon для дальнейшей концентрации центрифуги для ДНК при температуре от 5 000 до 10 000 G в течение одной-трех минут. Проверьте количество жидкости на фильтре и повторяйте центрифугирование до тех пор, пока количество жидкости на фильтре не уменьшится примерно до 50 микролитров.

Поместите фильтрующий блок вверх дном в новую пробирку MicroCon и центрифугируйте при 1000-кратном перегрузке в течение трех минут. Идеальное количество концентрированного раствора – от 50 до 60 микролитров. Перенесите образец ДНК в новую пробирку эйнора объемом 1,5 миллилитров.

Измерьте концентрацию ДНК в NanoDrop и проверьте пиковое качество. График поглощения для чистой ДНК должен иметь четкий пик на уровне 260 нанометров. Заморозьте остальную часть ДНК при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Когда этот протокол выполнен правильно, вы должны увидеть изображение геля, похожее на рисунок один: фактическая концентрация ДНК экстрактов будет варьироваться в зависимости от источника образца. Когда этот протокол выполнен правильно, вы должны четко видеть полосу ДНК посередине трубки. Как показано на втором рисунке, мы только что показали вам, как извлечь геномную ДНК из фильтров Sterex и очистить ее с помощью градиента плотности хлорида цезия.

При выполнении этой процедуры важно перед началом проверки наличия у вас всех необходимых реагентов и расходных материалов. А во-вторых, запланируйте как минимум три полных дня, чтобы у вас было достаточно времени для тщательного завершения процедуры. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.