Name: Микроинъекция методы для изучения митоза в Дрозофилы Синцитиальный эмбрионов (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Изучите метод микроинъекции для исследования митоза в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster с применением высокоразрешающей микроскопии. Этот подход позволяет детально анализировать динамику клеточного деления.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Этот протокол используется в настоящее время в нашей лаборатории и был усовершенствован в течение ряда лет многие люди, включая доктора Дэвида Шарпа, Mijung Квон, Патриция Sommi, Dhanya Cheerambathur. Мы благодарим Д-р Билл Салливан (УСК), который предоставил нам отличный совет на манипуляции и микроинъекции ранних эмбрионов дрозофилы, когда наша работа в этой системе в настоящее время начато (см. 13). Мы благодарим всех членов лаборатории Шоли. Наша работа на митоз у дрозофилы при поддержке гранта NIH GM55507.

Рецепты: Пластины Виноградный сок: <ul><li> 5,5 г Бакто агар </li><li> 14,5 г декстрозы или глюкозы </li><li> 7,15 г сахарозы </li><li> 45 мл концентрата виноградного сока (100% сока). </li><li> 204,5 мл H 2 0 </li><li> 625 мкл 10N NaOH </li></ul> Смешайте все ингредиенты и СВЧ до кипения. Добавить 2,8 мл кислоты смеси (смеси кислот: 20,9 мл пропионовой кислоты, 2,1 мл фосфорной кислоты, 27 мл H 2 0) Смешать и вылить на 35 мм чашки Петри. Давайте затвердевают при комнатной температуре в течение одного или двух дней. Если таблички не будет использоваться в ближайшее время, печать с парафильмом и хранить при температуре 4 ° C (разрешить, чтобы уравновесить до комнатной температуры перед использованием). Дрожжи пасты: Растворяют около одной чайной ложки дрожжей (Sigma YSC2, дрожжи Saccharomyces от CEREVISIAE тип II) в воде с образованием густой пасты. Нанесите небольшое количество этого на каждой пластине винограда сок непосредственно перед использованием. G-PEM буфера: <ul><li> 80 мМ Na-ТРУБЫ, рН 6,9 </li><li> 1 мМ MgCl 2 </li><li> 1 мМ EGTA </li><li> 1 мМ GTP </li></ul> Инъекция буфера: <ul><li> 150 мМ К-аспартата </li><li> 10 мМ К-фосфатном </li><li> 20 мМ имидазола, рН 7,2 </li></ul> Гептан клея: Разверните двойной клейкой лентой и поместите в бутылку 100 мл, добавляют 50 мл гептана о, печать бутылку, и рок в течение нескольких дней. При использовании, добавьте гептан, если клей слишком густой. Обезвоживание камеры: Возьмите 100 мм чашки Петри, положите одну часть 35 мм блюдо внутри, чтобы сделать &quot;стол&quot; и добавить Drierite (безводный сульфат кальция) вокруг него так, чтобы высота Drierite не выше, чем &quot;стол&quot; и крышкой. Покровное с эмбрионами будут размещены на этом &quot;стол&quot; для обезвоживания перед инъекцией. Это хорошая идея использовать по крайней мере некоторые указали, Drierite и изменить его, когда он изменил цвет. Протокол: Этот протокол может быть использован для инъекций практически любой растворимый реагента в дрозофилы синцитиального эмбриона: Например, как флуоресцентный белок для наблюдения или ингибитором белка-мишени или обоих. Получение все готово: 1 .- 2 до 3 дней до начала эксперимента, сделать виноградный сок пластин и настроить лежала клетке: Возьмите пластиковую бутылку (6 унций с круглым дном из прикладных научных дрозофилы), вырезать два маленьких отверстия (около 1 см 2) на противоположных сторонах бутылку и залейте хлопка кусок (это позволит воздуху поток), нажмите мух в бутылку и залить виноградным соком пластины. Хранить при температуре 25 ° С (или при комнатной температуре), мухи должны заложить эмбрионов в течение приблизительно 10 дней. 2 .- По крайней мере, за один день до эксперимента вытащить иглы для инъекций, мы используем иглы Kopf / Внесите съемник модели 720 и тонкостенных стеклянных нитей (Всемирный точных приборов tw100f). Для инъекций флуоресцентных тубулина, держите иглы при 4 ° С, чтобы предотвратить температуры индуцированной полимеризации в иглу. Тубулина подготовки: Примечание: Все работы с тубулина должно быть сделано при 4 ° С для предотвращения полимеризации. <ol><li> Возьмите помечены тубулина из холодильника и положить его на льду в течение 5 до 15 минут. </li><li> Разбавить G-буфера PEM (от 4 до 10 раз в зависимости от интенсивности требуется). </li><li> Центрифуга на 13k оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 10-15 минут. </li><li> Нагрузка 1 - 2 мкл в иглу. </li></ol> Антитела или химического ингибитора: Подготовка иглы также для тубулина, с использованием соответствующей концентрации (это возможно, должны быть проверены). Антитело может быть в инъекции буфера, G-буфера или PEM PBS. Если другой буфер нужен, этот буфер должны быть введены в качестве контроля, чтобы убедиться, этот буфер не вызывает никаких повреждений сам по себе. Примечание: Ингибитор и флуоресцентные тубулина могут быть смешаны и вводят вместе, если концентрация позволяет. В противном случае, вводить флуоресцентные тубулина и ждать от 5 до 10 минут перед инъекцией ингибитора. При выполнении двойного впрыска, начните с более эмбрионов, так как меньше эмбрионов будет восстанавливаться в обычном режиме. Эмбрион коллекции: <ol><li> Положите новой пластинкой виноградного сока на клетке лежала. </li><li> Удалить эту пластину через час, это первый сборник день и часто не очень хорошо. Она может быть отброшена. </li><li> Изменение пластины каждый час, чтобы держать сбора эмбрионов в течение одного часа каждый. </li></ol> Покровное подготовки: <ol><li> Положите 50 х 22 мм покровным с одной стороны стекло микроскопа. Лента четырех углах на слайд, чтобы он не двигаться. </li><li> Использование хлопка наконечником аппликатором, положить в один слой клея гептана в одну линию на покровное (клей не должен быть вязким и должен сохнуть в течение нескольких секунд, в противном случае добавить еще гептана). </li><li> Положите кусокдвойной липкой лентой на сползание к стороне покровного стекла. </li></ol> Эмбрион подготовки: Примечание: Эмбрионы должны быть отображены около 2 часов после начала сбора, чтобы начать следующие шаги обеспечивают достаточное время, чтобы закончить их в течение этого периода времени. <ol><li> С смоченной кистью тщательно подобрать эмбрионов от пластины виноградным соком и положите на двойной липкой лентой на слайде. </li><li> Использование внешней части пинцет, рулон эмбрионов над двойной липкой ленты, пока хориона (наружной мембраны) разрывается. </li><li> Возьмите эмбриона, осторожно прокатки его над хориона так он прилипает к пинцет и поместите его на гептан клея на покровное с длинной стороне эмбриона параллельно длинной стороне покровного стекла. Настройка от 10 до 20 эмбрионов в одном ряду. </li><li> Удалить покровное и поместить его в камеру для обезвоживания 3 до 8 минут (это зависит от влажности помещения и суммы, который будет введен). </li><li> Место на металлической камеры с вакуумной смазкой. </li><li> Обложка эмбрионов с галоидоуглеводородов 700 масла, чтобы избежать дальнейшего обезвоживания. Эмбрионы теперь готовы для инъекций. </li></ol> Эмбрион инъекций: <ol><li> Найти эмбрионов под 16x цели. </li><li> Перемещение эмбрионов далеко, и найти иголку без перемещения фокальной плоскости. </li><li> Центр иглы и переместить его вверх, не двигая его в х или у. </li><li> Если игла не открыто, положить край покровного в поле зрения, но не там, где игла будет, а нижняя игла же фокальной плоскости. Очень осторожно двигаться покровное, пока не встретит иглы и аккуратно разбивает его открытым. Если игла открытым, переходите к шагу 5. (Иглы можно открыть с помощью плавиковой кислоты до заполнения). </li><li> Положите эмбрионов с учетом (но не там, где игла будет), снижение иглу в нефти и убедитесь, что вы получите хорошие капли жидкости из иглы. </li><li> Осторожно, но уверенно двигаться эмбрион в иглу и вводят каплю в эмбрионе и двигаться эмбриона прочь. (Или следуйте инструкциям вашего инъекции аппарат). </li><li> В конце концов эмбрионы были введены, они готовы для наблюдения по конфокальной микроскопии. </li></ol> Получение изображений: Изображения эмбрионов на конфокальной микроскопии с 60 или 100X цель: Примечания: <ol><li> Отрезка времени, на серии промежуток времени должно быть не более нескольких секунд, так как митоз в эмбрион очень быстро, в зависимости от конкретного процесса, который будет изучен. </li><li> 3D-серии или одной плоскости может быть приобретено в зависимости от процесса, представляющих интерес. </li><li> Для быстрого действия ингибиторов, переход от инъекций микроскоп для визуализации микроскопа должно быть быстрым. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1382/1382fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1: Изучение митоза у дрозофилы синцитиального эмбриона. Ядер в раннем эмбрионе претерпевают быстрое подразделений без цитокинеза, во время циклов с 10 по 13 ядер форме монослоя в коре головного мозга.. Схема раннего эмбриона с ядрами при коры головного мозга. Эмбрион может выразить GFP и / или RFP меченых белков и может быть microinjected с другими меченых белков и / или ингибиторов. Б. Временной интервал изображения эмбрионов выражения GFP-тубулина и RFP-гистонов. С. земельный полюс-полюс разделения циклов 11 , 12 и 13 в дикой эмбриона типа. Длина шпинделя экспонатов периодов изометрических длины и периоды относительного удлинения, которые очень последовательным и воспроизводимым. Д. Динамика микротрубочек веретена. Введение низких концентрациях родамина тубулина приводит к крапинками формируется из нескольких субъединиц тубулина, которые могут быть использованы для изучения динамики микротрубочек.

<ol><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li>
<li>Morris, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+methods+for+analyzing+the+functions+of+kinesins+in+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos.</a> Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-5-dependent+poleward+flux+and+spindle+length+control+in+Drosophila+embryo+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+anaphase+B%3A+role+of+three+mitotic+motors+in+a+switch+from+poleward+flux+to+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+flux+and+sliding+in+mitotic+spindles+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).</li>
<li>Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+partitioning+of+mitotic+kinesin-5+crosslinkers+between+microtubule-bound+and+freely+diffusing+states%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states.</a> J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).</li>
<li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch%3A+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li>
<li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromokinesin%2C+KLP3A%2C+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bipolar+kinesin%2C+KLP61F%2C+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li>
<li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy%2C+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li>
</ol>

Этот протокол является относительно простым, тем не менее, каждый шаг требует практики, чтобы убедиться, эмбрионы не повреждены. Тщательные контрольные эксперименты всегда нужно сделать для того, что надежные результаты получаются. Один хороший способ начать это путем microinjecting буфера или родамин тубулина в контрольных эмбрионов выражения GFP-тубулина, чтобы убедиться, что митоз протекает нормально через все циклы на поверхности эмбриона (циклов с 10 по 13). В контрольных эмбрионов вы не должны заметить каких-либо ...

Микроинъекция методы для изучения митоза в Дрозофилы Синцитиальный эмбрионов

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Этот протокол описывает использование дрозофилы синцитиального эмбриона для изучения митоза 1. Дрозофилы имеет полезную генетики с геном последовательность, и ее можно легко сохранять и манипулировать. Многие мутанты митотической существует, и трансгенных мух выражения функциональных флуоресцентно (например, GFP) - меченый белков митотического были и в настоящее время генерируется. Целевые экспрессии генов можно с помощью системы GAL4/UAS 2. Дрозофилы раннего эмбриона проводит несколько митозов очень быстро (клеточного цикла продолжительность, ≈ 10 мин). Она хорошо подходит для работы с изображениями митоз, потому что во время циклов 10-13, ядра делятся быстро и синхронно, не вмешиваясь цитокинеза на поверхности эмбриона в одном монослое только под корой. Эти быстро делящихся ядер, вероятно, использовать те же механизмы митотического как и другие клетки, но они оптимизированы для скорости; контрольно-пропускного пункта, как правило, считается не строгим, позволяя изучение митотических белков, отсутствие которых может вызвать остановку клеточного цикла в клетках с сильным контрольно-пропускной пункт . Эмбрионы выражения GFP меченых белков или microinjected с флуоресцентно меченые белки могут быть легко отображаемого следовать жить динамики (рис. 1). Кроме того, эмбрионы могут быть microinjected с функцией блокировки антителами или ингибиторами специфических белков для изучения влияния потери или возмущении их функции 3. Эти реагенты могут диффундировать по всему эмбриона, достигнув многих шпинделей для получения градиента концентрации ингибитора, который, в свою очередь приводит к градиенту дефектов сравнимы с аллельных серий мутантов. В идеале, если целевой белок флуоресцентно меченных, градиент торможение может быть непосредственно визуализировать 4. Предполагается, что сильнейшие фенотип можно сравнить с нулевой фенотип, хотя трудно формально исключает возможность того, что антитела могут иметь доминирующую эффектов в редких случаях, так что строгий контроль и осторожная интерпретация должна быть применена. Подальше от укола, функции белка лишь частично потерял позволяющий другие функции белка-мишени, чтобы стать очевидным.

Этот протокол описывает использование микроинъекции и высоким разрешением в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Синцитиального эмбриона для изучения митоза.

В данном протоколе описывается использование синцитиального эмбриона Drosophila melanogaster для изучения митоза. Drosophila обладает полезными генетическими характеристиками с секвенированным...

Данная процедура начинается со сбора эмбрионов на чашки со свежим виноградным соком через 30–60 минут. После извлечения чашки из озерной клетки соберите эмбрионы с помощью увлажненной кисточки и поместите их на двусторонний скотч. Осторожно перекатите один эмбрион по ленте, используя одну сторону пинцета, до тех пор, пока хорион не разорвется.Поднимите эмбрион и аккуратно поместите его на покровное стекло. Нанесите слой клея HET. Повторяйте эти действия, пока не будет собрано достаточное количество эмбрионов.После обезвоживания эмбрионы готовы к инъекции. Здравствуйте, я Ингрид Брюс Машер из лаборатории доктора Джонатана Скалли с кафедры молекулярной и клеточной биологии Калифорнийского университета в Дейвисе. Сегодня мы продемонстрируем процедуру микроинъекции синцитиальных эмбрионов Drosophila.Мы используем данную процедуру для изучения роли микротрубочек и митотических моторных белков в митозе. Например, мы осуществляем микроинъекции антител или других ингибиторов специфических белков митоза. Анализируя влияние ингибитора на митоз, мы можем определить функцию белков-мишеней.Приступим к работе. Для начала подготовки за два-три дня до проведения эксперимента соорудите клетку для сбора яиц: прорежьте два небольших отверстия размером примерно 1 см² с противоположных сторон пластиковой бутылки. Заполните отверстия кусочками ваты, обеспечив при этом приток воздуха.Перебейте мух в флакон и накройте его чашкой с виноградным соком. В случае использования дрожжей держите клетку для ног при комнатной температуре; мухи будут откладывать яйца в течение до 10 дней, начиная как минимум за один день до эксперимента. Подготовьте иглы для инъекций и храните их при температуре 4 °C.В день проведения эксперимента подготовьте и загрузите иглы. Сначала извлеките помеченный тубулин из морозильной камеры и поместите его на лед на 5–15 минут. Затем разведите его буфером GPEM и центрифугируйте в течение 10–15 минут при 13 000 RPM и 4 °C.Наконец, внесите от одного до двух µL в иглу и храните её при температуре 4 °C, чтобы предотвратить индуцированную температурой полимеризацию в игле. Перед установкой покровного стекла приготовьте гептановый клей, свернув двусторонний скотч и поместив его в бутыль объемом 100 mL.Добавьте около 50 milliliters гептана, герметично закройте флакон и подвергайте его перемешиванию путем перекатывания в течение нескольких дней. Перед подготовкой эмбрионов создайте дегидратационную камеру, в которой эмбрионы будут находиться перед инъекцией. Для этого поместите чашку диаметром 35 millimeter внутрь чашки Петри диаметром 100 millimeter, чтобы создать «столик», и насыпьте вокруг него осушитель, представляющий собой безводный сульфат кальция, так чтобы высота осушителя была не выше уровня столика, затем накройте крышкой.Для начала подготовки эмбрионов сначала соберите их из озерной клетки, меняя каждые два часа планшет с виноградным соком и дрожжами; визуализацию эмбрионов следует проводить примерно через два часа после начала сбора. Для подготовки покровного стекла поместите его на одну сторону предметного стекла микроскопа и закрепите четыре угла лентой, чтобы оно не смещалось. С помощью ватного тампона нанесите один слой гептанового клея полосой на покровное стекло.Клей не должен быть вязким и должен высыхать за несколько секунд. Если он слишком густой, добавьте больше гептана. В завершение наклейте кусочек двустороннего скотча на предметное стекло рядом с покровным стеклом.Смочите кисть. Осторожно перенесите эмбрионы с чашки с виноградным соком и поместите их на двусторонний скотч на предметном стекле. Затем, используя один конец пинцета, перекатывайте эмбрионы по двустороннему скотчу до тех пор, пока хорион не разорвется.Подберите эмбрион, осторожно перекатывая его по поверхности Кориана, чтобы он прикрепился к пинцету, и поместите его на клей из гептана на покровном стекле. Расположите эмбрион так, чтобы его длинная сторона была параллельна длинной стороне покровного стекла. Поместите от 10 до 20 эмбрионов в один ряд.Снимите покровное стекло и поместите его в камеру для дегидратации на три–восемь минут. Время выдержки зависит от влажности воздуха в помещении и объема вводимого вещества. Затем поместите покровное стекло в металлическую камеру с вакуумной смазкой.Наконец, накройте эмбрионы галокарбоновым маслом, чтобы предотвратить их дальнейшее обезвоживание. Теперь эмбрионы готовы к инъекции. Сначала найдите эмбрионы, используя объектив 16 x.Отодвиньте эмбрионы и найдите иглу, не меняя фокальной плоскости. Центрируйте иглу и переместите ее вверх, избегая смещения по осям X или Y. Чтобы открыть иглу, поместите край покровного стекла в поле зрения, но не в то место, где будет находиться игла.Опустите иглу в ту же фокальную плоскость. Очень осторожно перемещайте покровное стекло до тех пор, пока оно не коснется иглы и аккуратно не вскроет образец. Поднимите иглу.Теперь найдите эмбрионы в поле зрения. Опустите иглу в масло, убедившись, что из иглы выходят аккуратные жидкие капли. Плавно подведите эмбрион к игле, введите каплю в эмбрион, а затем отведите эмбрион в сторону.После завершения инъекций всех эмбрионов их можно подвергнуть наблюдению на конфокальном микроскопе с объективом 60х или 100х. Контрольный эмбрион должен выглядеть как экземпляр в данном видео. Здесь представлен эмбрион, экспрессирующий GFP-тубулин и RFP-гистон, визуализированный с помощью объектива 100х на конфокальном микроскопе с вращающимся диском.Общее время составляет восемь минут. Графики расстояния от полюса к полюсу обладают высокой воспроизводимостью и являются надежным показателем успеха в контрольных эмбрионах. Они должны выглядеть так же, как показано здесь для циклов с 11 по 13.В данном видео показан еще один контрольный эмбрион. В этом образце экспрессируется KLP 61 FGFP, и в него был введен r Domine tubulin. Съемка также проводилась с использованием объектива 100x на конфокальном микроскопе с вращающимся диском; общая продолжительность записи составляет семь минут.Данное видео было записано сразу после микроинъекции; в начале ролика отчетливо виден градиент концентрации r Domine тубулина. Эти эмбрионы можно использовать для изучения ингибирования Klp 61 F после микроинъекции антител к Klp 61 F. Мы наблюдаем исчезновение Klp 61 FGFP из веретен деления.Мы только что продемонстрировали вам способ микроинъекций в эмбрионы дрозофилы на стадии дробления. При выполнении данной процедуры важно не забывать о проведении контрольных экспериментов: сначала потренируйтесь вводить только буфер или рутин, и убедитесь, что митоз протекает нормально вплоть до стадии целлюляризации. Как только ваши инъекции станут стабильными и перестанут наносить повреждения, вы сможете вводить ингибитор и изучать эффект конкретного ингибирования.На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.

microinjection-techniques-for-studying-mitosis-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Дрозофилы гемоциты расходиться по совокупности развивающегося эмбриона. Этот протокол демонстрирует, как монтировать и изображение этих миграций использованием эмбрионов с флуоресцентно меченных гемоциты.

Живая съемка Дрозофилы Эмбриональные миграции гемоцитов

Кинетохора где SAC инициирует его сигнал контроля митотической сегрегации сестринских хроматид. Описан способ визуализировать набор и оборот одного из кинетохора белков и ее координации с хромосомой...

Изучение митоза Checkpoint, иллюстрируя динамического поведения белков кинетохора и хромосомы движения в живых<em&gt; Drosophila</em&gt; Синцитиальный эмбрионов

Из-за своего большого размера и относительно простой организации, клетки-медсестры дрозофилы идеально подходят для исследований визуализации живых клеток. В этом видео описывается метод микроинъекции для доставки экзогенных соединений в клетки, а в представленном протоколе демонстрируется процедура с помощью флуоресцентных олигонуклеотидных зондов, называемых молекулярными маяками (MB), используемых для визуализации эндогенных транскриптов мРНК.

Микроинъекции клеток-кормилиц дрозофилы: метод внутриклеточной доставки

В этом видео описывается, как выполнять микроинъекции, которые доставляют реагенты в живые эмбрионы дрозофилы. Исследователи могут использовать этот метод для введения экзогенных соединений, таких как нуклеиновые кислоты и белки, на ранних стадиях развития эмбриона. Представленный протокол демонстрирует, как настроить и выполнить процедуру инъекции любого растворимого реагента — в данном случае флуоресцентного белка для экспериментов с визуализацией в реальном времени.

Микроинъекции живых эмбрионов дрозофилы: ранняя доставка реагентов развивающемуся эмбриону

Мы представляем технику для маркировки отдельных нейронов в центральной нервной системе...

Маркировка отдельных клеток в центральной нервной системе<em&gt; Дрозофилы</em

Здесь мы представляем протокол для визуализации, обнаружения, анализа и отслеживания эндогенной торговли мРНК в живой дрозофилальной меланогастерской яичной камере с использованием молекулярных маяков, вращающейся дисковой конфокальной микроскопии и анализа с открытым исходным кодом Программного обеспечения.

Визуализация и отслеживание эндогенных мРНК в Live Drosophila меланогастер яйцо палаты

Цель этого протокола заключается в том, чтобы ввести родамина конъюгированных шаровых актин в дрозофила эмбрионов и изображения внутриядерных актин стержня сборки после теплового стресса.

Изображение Внутриядерных Actin Роды в Live Heat подчеркнул Drosophila эмбрионов

Здесь представлен протокол микроинъекционного и одновременного изображения нескольких эмбрионов дрозофилы во время эмбрионального развития с использованием изображения на основе пластин с высоким содержанием.

Дрозофила Эмбрион Подготовка и микроинъекция для live Cell Микроскопия Выполняется с помощью автоматизированного анализа высокого содержания

В этой статье в качестве примера берется интегразо-опосредованный трансгенез phiC31 у дрозофил и представлен оптимизированный протокол микроинъекции эмбриона, что является важным шагом для создания трансгенных мух.

Микроинъекция эмбриона для трансгенеза у дрозофилы

Здесь мы предоставляем подробный протокол для выполнения визуализации асимметричного деления стволовых клеток зародышевой линии (GSCs) в нише яичников дрозофилы. Мы используем трансгенную линию, которая повсеместно экспрессирует слияние зеленого флуоресцентного белка (GFP) со спектросомным белком Par-1.

Расширенная визуализация в реальном времени ниш зародышевых стволовых клеток самки Drosophila melanogaster

Эти протоколы описывают, как охарактеризовать организацию и окклюзионную функцию соединений с плиссированными перегородками в контроле и мутантном эмбриональном эпителии Drosophila.

Эксперименты по иммуноокрашиванию и проникновению красителя для определения белков соединения ядра с плиссированными септатами в эмбриональном эпителии дрозофилы

Изучите метод микроинъекции для исследования митоза в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster с применением высокоразрешающей микроскопии. Этот подход позволяет детально анализировать динамику клеточного деления.

Микроинъекция методы для изучения митоза в Дрозофилы Синцитиальный эмбрионов

Больше видео