Микроинъекция методы для изучения митоза в Дрозофилы Синцитиальный эмбрионов

Эта процедура начинается со сбора эмбрионов на тарелках со свежим виноградным соком от 30 до 60 минут. Сняв пластину с озерной клетки, поднимите эмбрионы смоченной щеткой и поместите их на двойную липкую ленту. Аккуратно прокатайте один эмбрион по ленте с помощью половины пинцета, пока корион не раскроется.

Возьмите эмбрион и аккуратно положите его на крышку. Нанесите слой клея. Повторяйте это до тех пор, пока у вас не будет достаточно эмбрионов.

После обезвоживания эмбрионы готовы к инъекции. Здравствуйте, я Ингрид Брюс Мушер из лаборатории доктора Джонатана Скалли на кафедре молекулярной и клеточной биологии Калифорнийского университета в Дэвисе. Сегодня мы покажем вам процедуру микроинъекции дрозофил синцитиальным эмбрионам.

Мы используем эту процедуру для изучения роли микро тт и моторов на основе митрального канала в митозе. Например, мы вводим микроинъекции антител или других ингибиторов определенных митотических белков. Анализируя влияние ингибитора на митоз, мы можем определить функцию белков-мишеней.

Итак, приступим. Чтобы начать подготовку за два-три дня до эксперимента, установите клетку для несушек, вырезав два небольших отверстия площадью около одного квадратного сантиметра на противоположных сторонах пластиковой бутылки. Заполните отверстия кусочком хлопка, позволяя воздуху поступить.

Вбейте мух в бутылку, а затем накройте ее пластиной с виноградным соком. При использовании дрожжей держите клетку для ног при комнатной температуре, мухи будут откладывать яйца до 10 дней, по крайней мере, за один день до эксперимента. Вытащите иглы для инъекции и держите их при температуре четыре градуса Цельсия.

В день эксперимента подготовьте и загрузите иглы. Сначала достаньте маркированный тубулин из морозилки и положите его на лед на пять-15 минут. Затем разбавьте его буфером GPEM, а затем центрифугируйте в течение 10-15 минут при 13 000 об/мин при четырех градусах Цельсия.

Наконец, загрузите в иглу один-два микролитра и держите ее при температуре четыре градуса Цельсия. Для предотвращения полимеризации, вызванной температурой, в игле. Перед установкой покровного стекла сделайте гептановый клей, намазав двойной липкий скотч и поместив его в бутылку объемом 100 миллилитров.

Добавьте около 50 миллилитров гептана, закупорьте бутылку и раскачивайте ее в течение нескольких дней. Перед подготовкой эмбрионов сделайте камеру обезвоживания, в которую эмбрионы будут помещены перед инъекцией. Для этого поставьте одну часть 35-миллиметровой посуды внутрь 100-миллиметровой чашки Петри, чтобы сделать стол с добавлением сушилки, справа, которая представляет собой безводный сульфат кальция вокруг нее так, чтобы высота сушилки справа была не выше стола и крышки.

Чтобы начать подготовку эмбрионов, сначала соберите их из озерной клетки, меняя пластину виноградного сока на дрожжи каждый час, эмбрионы должны быть визуализированы примерно через два часа после начала сбора. Чтобы подготовить защитный листок, поместите его на одну сторону микроскопа, сдвиньте и заклейте скотчем четыре угла, чтобы он не двигался. С помощью аппликатора с ватным наконечником нанесите один слой гептанового клея в линию на покровное полотно.

Клей не должен быть вязким и должен высохнуть за несколько секунд. Если он слишком густой, добавьте еще гептана. Наконец, наденьте кусок двойной липкой ленты на предметное стекло рядом с крышкой.

Проведите смоченной щеткой. Осторожно возьмите эмбрионы с тарелки с виноградным соком и поместите их на двойную липкую ленту на предметном стекле. Затем используйте одну половину пинцета, чтобы раскатать эмбрионы по двойной липкой ленте, пока корион не раскроется.

Возьмите эмбрион, аккуратно прокатав его по кориану, чтобы он прилип к пинцету, и поместите его на гептановый клей на крышке. Слип так, чтобы длинная сторона зародыша была параллельна длинной стороне покровного слипа. Поместите от 10 до 20 эмбрионов в один ряд.

Снимите крышку и поместите ее в камеру обезвоживания на три-восемь минут. Время зависит от местной влажности и количества вводимого препарата. Далее поместите крышку на металлическую камеру с вакуумной смазкой.

Наконец, накройте эмбрионы галоуглеродным маслом, чтобы избежать дальнейшего обезвоживания. Теперь эмбрионы готовы к инъекции. Во-первых, найдите эмбрионы с целью 16-кратного увеличения.

Отодвиньте эмбрионы и найдите иглу, не перемещая фокальную плоскость. Центрируйте иглу и переместите ее вверх, не перемещая в направлении X или Y. Чтобы открыть иглу, положите край чехла слипа в поле зрения, но не туда, где будет иголка.

И опускаем иглу в ту же фокальную плоскость. Очень осторожно двигайте покровную крышку до тех пор, пока она не попадет в иглу и аккуратно не разломает ее. Переместите иглу вверх.

Теперь рассмотрим эмбрионы. Опустите иглу в масло и убедитесь, что из иглы получаются приятные капли жидкости. Постепенно переместите эмбрион в иглу, введите каплю в эмбрион, а затем переместите эмбрион.

После того, как все эмбрионы были введены, они готовы к наблюдению на конфокальном микроскопе с объективом 60 или 100 крат. Контрольный эмбрион должен выглядеть так, как в этом фильме. Это эмбрион, экспрессирующий тубулин GFP и гистон RFP, визуализированный с помощью объектива со 100-кратным увеличением на конфокальном микроскопе с вращающимся диском.

Общее отображаемое время составляет восемь минут. Графики расстояния от полюса до полюса очень воспроизводимы и являются надежным показателем успеха в контрольных эмбрионах. Они должны выглядеть так, как показано здесь для циклов с 11 по 13.

В этом фильме показан еще один контрольный эмбрион. Он экспрессирует KLP 61 FGFP и вводит тубулин r Domine. Это также было снято с помощью объектива с 100-кратным увеличением на вращающемся диске, а общее время составляет семь минут.

Этот снимок был получен сразу после микроинъекции, и градиент концентрации r Domine tubulin хорошо виден в начале фильма. Эти эмбрионы могут быть использованы для изучения ингибирования Klp 61 F после микроинъекции антител Klp 61 F. Мы видим потерю Klp 61 FGFP от шпинделей.

Мы только что показали вам, как делать микроинъекции эмбрионов с помощью микроинъекций дрозофилам. При выполнении этой процедуры важно помнить о выполнении контрольных работ, сначала попрактиковаться в введении только буфера или рутина и убедиться, что митоз протекает нормально через клеточную систему. Как только все ваши инъекции станут надежными и не причинят вреда, вы можете ввести ингибитор и изучить эффект этого конкретного ингибитора.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.