Multi-купе ЦНС Нейрон-глии сотрудничеству культуры микрожидкостных платформы

Изготовление многокамерного микрофлюидного устройства для совместного культивирования нейронов начинается с формирования резервуаров на блоке из PMMA с помощью фрезерного станка, после чего следует горячее тиснение массивов микроканалов, соединяющих камеры. После подготовки формы из PMMA на ее основе создается мастер-форма из PDMS, которая затем покрывается трихлорэтиленом. Готовое устройство отливается по мастер-форме из PDMS и собирается на культуральной планшете с покрытием из PDL.

Затем первичные нейроны крыс стадии E 16–18 помещают в соматический отдел и культивируют в течение двух недель, после чего для создания кокультуры на аксональные слои внутри отдела аксонов GGL добавляют олигодендроциты крыс стадии P 1–2. Здравствуйте, я Джей Пар из лаборатории нанобиосистем факультета электротехники и компьютерной инженерии Техасского университета A&M. Сегодня мы продемонстрируем процедуру изготовления многокамерной микрофлюидной платформы для кокультивирования нейронов.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения взаимодействия нейронов и глии центральной нервной системы in vitro. Итак, приступим. Для начала данной процедуры используйте микрофрезерный станок, чтобы создать отсеки глубиной 3.5 millimeter.

В блоке A-P-M-M-A определите один компартмент сомы и шесть компартментов аксона ggl. После подготовки компартментов обработайте их ультразвуком в изопропаноле в течение 10 минут для удаления загрязнений, создайте структуры микроребер на стеклянном предметном стекле с помощью стандартной фотолитографии и процесса мокрого травления, затем методом горячего тиснения перенесите рисунок микроребер со стекла. Установите предметное стекло на мастер-форму из ПММА, вручную совместите мастер-форму из ПММА и стеклянную подложку.

Затем с помощью горячего пресса поднимите температуру до 115 °C. По достижении заданной температуры приложите нагрузку 0,5 тонны в течение пяти минут. По истечении пяти минут охладите образец до 40 °C и снимите давление.

Теперь приступите к подготовке мастер-формы из PDMS. Смешайте преполимер PDMS с отвердителем в массовом соотношении 10:1; нарежьте мастер-форму из ПММА на блоки размером 50 мм на 50 мм. С помощью лобзика поместите блок в контейнер и залейте мастер-форму из ПММА смесью PDMS, затем поместите контейнер в эксикатор, подключенный к вакуумному насосу и дегазатору, на 15 минут.

Для удаления пузырьков, образовавшихся в процессе смешивания PDMS. После удаления всех пузырьков поместите контейнер в выровненный oven при температуре 85 °C на один час для полимеризации. После полного отверждения PDMS отделите мастер-форму из PDMS от мастер-формы из PMMA; проведите парофазное покрытие мастер-формы из PDMS, поместив ее в эксикатор с двумя-тремя каплями трихлорэтилена, и создайте вакуум на 15 минут.

Покрытие мастер-формы из PDMS облегчает отделение готового устройства для совместного культивирования нейронов из мастер-формы PDMS. После нанесения покрытия мастер-форму PDMS кратковременно промывают изопропиловым спиртом для удаления избытков трихлорэтилена и высушивают потоком азота. Изготовление устройства для совместного культивирования нейронов из полимера PDMS аналогично подготовке мастер-формы PDMS, описанной в предыдущем разделе. Начните со смешивания преполимера PDMS с отвердителем в массовом соотношении 10:1, затем залейте смесь PDMS поверх мастер-формы PDMS. Важно не наливать слишком много PDMS, чтобы структура PDMS высотой 3.5 мм на мастер-форме не была полностью погружена.

Поместите DGA в эксикатор, подключенный к вакуумному насосу, на 15 минут. После полного удаления пузырьков воздуха поместите PDMS в выровненный по горизонтали oven при температуре 85 °C на один час для полимеризации. По истечении одного часа извлеките PDMS из oven и оставьте его при комнатной температуре для охлаждения. Затем аккуратно отделите устройства для культивирования нейронов из PDMS от мастер-формы PDMS.

Оберните устройства из PDMS парафильмом для защиты от пыли и загрязнений. Завершите процесс, разрезав обернутый в парафильм PDMS на отдельные части с помощью сверлильного пресса, оснащенного лезвием; после этого устройства из PDMS для совместного культивирования нейронов будут почти готовы к использованию в планшетах для культивирования клеток. Перед помещением устройства из PDMS для совместного культивирования нейронов в планшет для культивирования клеток поместите устройство в установку для плазменной очистки и подвергните воздействию воздушной плазмы в течение 90 секунд для придания поверхности гидрофильности.

Данная обработка облегчит заполнение микроканалов питательной средой после закрепления устройства на планшетах, покрытых поли-L-лизином. Для стерилизации устройства, прошедшего плазменную обработку, погрузите его в 70% ethanol на 30 минут, после чего переместите контейнер в стерильный ламинарный шкаф. Через 30 минут извлеките устройство и высушите его азотом, прошедшим через millipore-фильтр с порами 0,2 мкм.

Затем поместите высушенные устройства на поверхность полистирольной 6-луночной культуральной пластины, покрытой поли-D-лизином, и слегка прижмите их, чтобы обеспечить герметичное прилегание льда устройства к поверхности пластины. Теперь заполните соматический отдел культуральной средой. Подождите одну или две минуты, чтобы убедиться, что в микроканалах не осталось пузырьков воздуха.

Затем заполните шесть камер для аксонной глии. В завершение инкубируйте устройства, заполненные культуральной средой, в инкубаторе при 37 °C в течение ночи, чтобы удалить возможные загрязнения или токсичные остатки. После ночной инкубации можно приступать к культивированию в рамках подготовки к загрузке клеток в устройство.

С помощью пипетки аспирируйте культуральную среду из камер сомы и аксона. Затем внесите 40 µL первичных нейронов переднего мозга крыс 16–18 эмбриональных суток в камеру сомы вокруг входов в микроканалы с плотностью посева 500 клеток на квадратный миллиметр. Важно не касаться устройства из PDMS во время внесения клеток, так как это может нарушить герметичность соединения между устройством и планшетом для культивирования клеток.

На этих микроскопических изображениях показаны нейроны, окрашенные на кальций. Внутри соматического отдела клетки распределены равномерно и расположены в непосредственной близости от микрофлюидных каналов. Инкубируйте устройства с загруженными клетками в течение 30 минут в инкубаторе при 37 °C для улучшения адгезии клеток к подложке.

После этой инкубации заполните все отсеки культуральной средой. Поддерживайте рост клеток в устройстве при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2, заменяя только половину культуральной среды каждые три или четыре дня. В отсеках Axon glia должна сформироваться плотная аксональная сеть.

После двух недель культивирования в первичные нейроны in vitro добавляют клетки CLIA. Перед внесением клеток аспирируют примерно 60% культуральной среды из камер. Олигодендроциты выделяли из церебральных полушарий крыс Sprague Dawley на 1-2 postnatal день. Добавьте 5 µL суспензии олигодендроцитов в каждую камеру «аксон-глия» с плотностью посева 1000 клеток на 1 мм². При внесении клеток следует проявлять осторожность, чтобы не коснуться пипеткой нижнего субстрата, так как это может повредить сформированную на субстрате аксональную сеть. После добавления олигодендроцитов инкубируйте клетки в течение одного часа при 37 °C, затем заполните камеры до полного объема.

Продолжайте культивировать нейроны в питательной среде, как и до добавления CLIA; в течение следующих двух недель при изучении взаимодействия аксонов и глии центральной нервной системы млекопитающих заменяйте только половину питательной среды каждые три или четыре дня. При правильном проведении экспериментов нейроны, помещенные в соматический отдел, располагаются вблизи входов в микроканалы, и в отделах axon Ggl начинает формироваться аксональный слой.

После одной недели культивирования появление признаков агрегации нейронов внутри соматического компартмента может указывать на неблагополучный статус клеток при загрузке олигодендроцитов. После двух недель культивирования нейронов аксональные компартменты должны быть покрыты плотным слоем аксонов, а олигодендроциты следует загружать поверх аксонального слоя. Мы только что продемонстрировали вам способ создания многокомпартментной платформы для нейрокультуры и метод её использования для изучения взаимодействия нейроглии ЦНС in vitro.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости защищать устройства от пыли и не стерилизовать их в этаноле слишком долго, так как это может привести к ухудшению качества соединения. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.