Эмбриональные ткани Целевые химерами: данио рерио Гаструла клеточной трансплантации

Данная процедура начинается с размещения эмбрионов данио-рерио на одноклеточной стадии в планшете для микроинъекций. В желточный мешок вводится раствор флуоресцентного декстрина с помощью микроинъекции. Эмбрионы, находящиеся в ряду непосредственно под инъецированными клетками, будут служить донорами для трансплантации.

Покройте эмбрионы донора и реципиента и выращивайте их до стадии щита. Поместите два эмбриона, в которых проведены инъекции декстрина с покрытием DEC, бок о бок в одну лунку планшета для трансплантации. Повторите процедуру для каждой пары доноров ниже. Добавьте по одному эмбриону реципиента в каждую лунку, чтобы направить трансплантированные клетки в будущий дицефалон переднего мозга; перемещайте клетки от средней линии и к ней.

На полпути между анимальным полюсом и щитом. Пересадите клетки из донорской газы в газу реципиента. Выращивайте до 30 часов, затем зафиксируйте.

При необходимости проведите иммунохимический анализ, затем зафиксируйте образец и выполните визуализацию. В качестве альтернативы можно зафиксировать живого хозяина и провести таймлапс-визуализацию. Здравствуйте, меня зовут Элизабет Де Шейн, я из лаборатории доктора Майкла Эси с кафедры биологических наук Смит-колледжа в Нортгемптоне, штат Массачусетс.

А я, доктор Майкл Беси, являюсь руководителем лаборатории. Сегодня мы покажем вам, как создавать химерные эмбрионы путем трансплантации клеток на гаструляционной стадии с использованием модельной системы Danio rerio. В моей лаборатории эта процедура применяется для изучения функции специфических генов в развитии комиссур переднего мозга, а также процессов аксонно-глиальных взаимодействий при формировании комиссур.

Итак, приступим. Для начала подготовьте формы-желоба для планшетов для микроинъекций, аккуратно разломив пополам три нефиламентных капилляра диаметром 1 мм и длиной 4 дюйма. С помощью суперклея приклейте две половины капилляров бок о бок к плоской поверхности.

Разместите третий капилляр поверх этих двух, установив его в паз так, чтобы получилась форма пирамиды. Оставьте форму с тремя капиллярами до полного высыхания. Для каждой инъекционной пластины следует изготовить от трех до пяти форм.

Затем подготовьте планшеты для инъекций, налив от 20 до 25 миллилитров расплавленного 1,5% агароза в среду для эмбрионов в чашку Петри диаметром 100 миллиметров. Немедленно поместите от трех до пяти подготовленных форм для желобков на дно чашки, убедившись, что плоская сторона формы прилегает к дну чашки Петри и полностью покрыта агарозой. После затвердевания агарозы извлеките формы для желобков, вырезав вокруг них большой квадрат из агарозы.

Осторожно отделите агар по периферии вырезанного квадрата и удалите его. Переверните квадратный фрагмент агара и с помощью тонкого пинцета полностью удалите формы для желобков. Залейте расплавленный агар в чашку Петри вокруг квадрата, чтобы зафиксировать только что сформированные лунки.

Дайте препарату застыть. Пластины можно запечатать парафильмом и хранить в течение нескольких недель при температуре 4 °C. Их следует утилизировать при появлении любых признаков роста в агаре.

Наконец, для подготовки игл для инъекций используйте микропипеточный вытягиватель, чтобы изготовить иглы из четырехдюймовых стеклянных капилляров диаметром один миллиметр с внутренними нитями; после этого планшет для микроинъекций и иглы будут готовы. Перейдем к сбору эмбрионов и настройке аппарата для микроинъекций. Оплодотворенные яйца собирают сразу после их откладки и содержат в чашке Петри, заполненной средой для эмбрионов.

С помощью стеклянной пипетки с широким наконечником перенесите эмбрионы в лунки планшета для инъекций, находящегося при комнатной температуре и заполненного средой для эмбрионов. С помощью зажимных тупых пинцетов осторожно прижмите эмбрионы ко дну желобков; эмбрионы с поврежденным хорионом или желтком следует удалить.

Затем заполните инъекционную иглу одним или двумя µL разведенного раствора флуоресцентного декстрина Alexa 5 9 4. Дайте декстрину переместиться к кончику инъекционной иглы за счет капиллярного эффекта. Закрепите инъекционную иглу в капиллярном держателе стереотаксического микроманипулятора и предварительно настройте давление на аппарате микроинъектора.

от 40 до 50 PSI и длительность импульса 500 миллисекунд. С помощью пинцета осторожно заденьте или срежьте кончик иглы для инъекций, чтобы нарушить герметичность. В идеале диаметр должен составлять от 0,05 до 0,15 миллиметров.

Для калибровки иглы используйте стереомикроскоп и вытесните декстрин на микрометр, покрытый минеральным маслом. Регулируйте размер болюса, изменяя длительность подачи воздуха при импульсе и диаметр иглы. Совет: на протяжении всего процесса инъекций следует поддерживать размер болюса, эквивалентный объему от 0,8 до 1 нанолитра.

Теперь можно приступить к микроинъекции декстрина, используя увеличение стереомикроскопа примерно 3,2x. Начните инъекции в эмбрионы с одного конца лотка, плавно прокалывая хорион и клеточную мембрану эмбрионов для проникновения в желток. Вводите раствор декстрина непосредственно под клетку.

Убедитесь, что извлечение инъекционной иглы выполняется таким же плавным движением, каким она вводилась в эмбрион. Перемещайте чашку Петри, чтобы следующее по очереди эмбрион оказался в нужном положении, и продолжайте вводить препарат вдоль желоба. Периодически проверяйте давление и размер болюса.

Теперь с помощью пинцета аккуратно извлеките эмбрионы из желобков. Перенесите их в чашку Петри, наполненную антибиотической средой для эмбрионов. Инкубируйте эмбрионы при температуре 28.5 °C и отслеживайте наличие неоплодотворенных и погибших икринок.

Эмбрионы теперь готовы к последующей трансплантации. До завершения процесса полигастрации части желтка остаются открытыми. Желток крайне хрупкий, он может прилипнуть к пластику чашки Петри и легко порваться.

Таким образом, эмбрионы необходимо поместить на подготовленные планшеты за день до проведения трансплантации. Подготовьте такие планшеты для декорации, налив от 5 до 10 мл расплавленного агароза в чашку Петри диаметром 100 мм. Для создания поддерживающей подушки под эмбрионами во время декорации достаточно тонкого слоя агарозы толщиной около 2–3 мм.

Дайте чашкам остыть. Затем подготовьте отдельные чашки для пересадки, налив 30 миллилитров 1.5% агарового раствора в чашку Петри диаметром 100 миллиметров, и установите форму для лунок пересадки. Форма должна содержать 104 треугольных углубления, каждое из которых состоит из трех сторон под углом 90 градусов и одной стороны под углом 45 градусов.

Лунки предназначены для размещения двух эмбрионов рядом друг с другом. Следите за тем, чтобы под формой не оставалось пузырьков воздуха, и дождитесь затвердевания агарозы. После снятия формы откроется углубление, содержащее квадратные лунки со скошенными краями.

Для подготовки эмбрионов реципиента и донора к трансплантации необходимо контролировать их развитие, чтобы обеспечить максимально близкое соответствие по возрасту. Для этого эмбрионы можно выращивать при различных температурах от 23 до 31 °C, чтобы замедлить или ускорить развитие. Эмбрионы реципиента и донора следует вручную перенести на покрытую планшетку за один час до достижения требуемого возраста.

В случае трансплантации на стадии гаструляции процедуру необходимо завершить к пяти часам после оплодотворения (HPF), то есть до наступления стадии щита (5,5 HPF). С помощью стеклянной пипетки перенесите эмбрионы-реципиенты и эмбрионы-доноры в планшет для трансплантации, заполненный антибиотической средой для эмбрионов. В данном случае первый ряд заполняется эмбрионами-донорами по два эмбриона на лунку, а следующие два ряда — по одному эмбриону-реципиенту на лунку.

Для трансплантации мы используем флуоресцентный стереомикроскоп Zeiss с люером, оснащенный полностью автоматизированным управлением зумом и фокусировкой с помощью джойстика. Хотя этот автоматизированный микроскоп не является обязательным, он значительно облегчает и повышает эффективность проведения таких тонких хирургических трансплантаций, особенно когда требуется большое количество пересадок. Чтобы подготовить аппарат для трансплантации, установите воздушный привод einor в среднее положение его шкалы, подсоедините трубку воздушного привода к держателю капилляра и закрепите держатель в автоматизированном микроманипуляторе einor. После подготовки эмбрионов и аппарата для трансплантации можно переходить к пересадке клеток на стадии гаструляции.

Наиболее важным навыком при выполнении трансплантации клеток на стадии гаструляции является умение распознавать клеточную анатомию дорсальных бластодеров APO lip, также известных как «щит» у данио-рерио. Здесь мы представляем серию кадров гаструлы с разных ракурсов и показываем расположение щита при виде сбоку. Щит или дорсальная сторона находится справа, отмечена красным контуром, чтобы определить клетки-мишени для трансплантации в передний мозг и в срединную линию.

Ровно посередине между анимальным полюсом и щитом мы начнем поворачивать эмбрион сначала на вас, чтобы рассмотреть анимальный полюс, по пути выделяя щит и место трансплантации. Затем эмбрион вращается вокруг своей оси так, чтобы щит оказался внизу. После этого гаструла снова поворачивается вверх, обеспечивая прямой вид на дорсальную сторону.

Затем эмбрион последовательно поворачивают обратно до бокового вида на стадии 6 часов после оплодотворения (HPF). С помощью микроманипулятора осторожно коснитесь эмбриона кончиком капилляра, чтобы повернуть его в положение для экстракции клеток, при котором его срединная линия и щит будут видны и находиться напротив кончика капилляра; донорские эмбрионы легко проверить, переключившись с яркого поля на флуоресцентное освещение. В данном случае клетки гаструлы флуоресцируют красным цветом. Аспирируйте небольшое количество среды для эмбрионов в капилляр, чтобы исключить любой контакт клеток с границей раздела воздуха и воды, который мог бы их повредить.

Осторожно проколите эктодерму эмбриона-донора по средней линии точно между анимальным полюсом и щитом. В данной области между поверхностной эктодермой и подлежащим желтком находится слой клеток толщиной всего около 20 micrometers. Будьте осторожны, чтобы не проткнуть желток, так как это часто приводит к гибели эмбриона в течение нескольких часов.

С помощью воздушного тракта медленно аспирируйте клетки в капилляр. Постоянно следите за уровнем жидкости, слегка встряхивая кончик капилляра. Нахождение внутри донора поможет ослабить межклеточные контакты.

Из эмбриона-донора следует извлечь примерно от 10 до 50 клеток. Затем извлеките капилляр из донора. Расположите эмбрион-реципиент аналогичным образом, проколите его и вытолкните клетки точно в то же место в эмбрионе-реципиенте; переключение с яркого поля на флуоресцентное освещение позволяет проследить перемещение меченых декстрином клеток из капиллярной иглы в эмбрион-реципиент.

Наконец, после трансплантации извлеките эмбрионы донора и реципиента из лунок. Разделите их и осторожно перенесите в чашку Петри с антибиотиком, заполненную средой для эмбрионов. Инкубируйте эмбрионы при температуре 28,5 °C; на этом трансплантация завершена.

Перейдем к визуализации и получению изображений. Начните с фиксации эмбрионов на соответствующей стадии развития в консерванте, проверенном для иммунохимического анализа. В нашем случае это будет 4% formaldehyde в течение двух часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C при перемешивании.

Затем промойте фиксированные эмбрионы дважды, после чего выдержите их в 0,1 M pb в течение трех-пяти минут. При необходимости проведите соответствующее иммуномаркирование.

Поместите эмбрионы в 75% глицерин, выдержите их при комнатной температуре, а затем храните при температуре четырех градусов Цельсия. Подготовьте предметное стекло для закрепления двух эмбрионов, создав на нем два квадратных контура из вазелина, соответствующих внутреннему диаметру покровного стекла. Положите покровное стекло рядом с эмбрионом и выполните необходимые диссекции для получения фронтального вида переднего мозга.

Отделите передний мозг, сделав перпендикулярный разрез по среднему мозгу. Поместите эту ткань в петролей с минимальным количеством глицерина. Аккуратно сориентируйте ткань в нужном положении и накройте образец покровным стеклом.

В качестве альтернативы, живые эмбрионы помещают в 0,75% раствор агарозы на стеклянное дно чашек для культивирования. До затвердевания агарозы с помощью вольфрамовой иглы эмбрион переводят в нужное положение для визуализации. Снимки делают как фиксированных, так и живых хозяев.

С помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica SP с пятью лазерами регистрировались Z-стеки, а обработка трех- или четырехмерных изображений проводилась с использованием программного обеспечения Velocity для создания химерных эмбрионов, в которых часть популяции астроглии внутри эмбриона отличается по генотипу или фенотипу. Мы применили многогранный подход, сочетающий использование трансгенных эмбрионов GFP, которые маркируют астроглию, с трансплантацией клеток на стадии гаструляции для специфического направления наших клонов в головной отдел (цефалон). Мы использовали карту судеб гаструляции данио-рерио для селективного извлечения клеток по срединной линии на равном расстоянии от анимального полюса и щита.

Затем эти экстрагированные клетки пересаживали в то же место хозяину дикого типа, которого затем выращивали до 30 HPF и подвергали иммуномаркировке всех аксонов для использования их в качестве ориентиров анатомии переднего мозга. В представленном здесь примере конфокальная визуализация одного эмбриона хозяина выявляет изолированные GFP-положительные клетки по всей головной части и цефалоне. Полная морфология этих GFP-положительных клеток может быть изучена с помощью данного клонального анализа, который показывает, что большинство этих клеток приобретают характерную морфологию радиальной глии, при которой сома расположена рядом с вентрикулярной зоной, а крупная концевая ножка завершает радиальный отросток на поверхности пелликулы.

Трехмерная реконструкция стека этих собранных оптических срезов наглядно демонстрирует положение данных клеток относительно меченых аксонов. Другим подходом, часто используемым для визуализации трансплантированных клеток, является предварительное микроинъекционное введение флуоресцентного красителя для отслеживания клеточных линий в желток эмбриона дикого типа или трансгенного эмбриона GFP на стадии одной клетки. В данном примере мы вводили декстран Alexa 594 в эмбрионы дикого типа.

На стадии одной клетки мы дали им развиться до стадии гаструлы, а затем провели четыре трансплантации в области мозга, как упоминалось выше. Однако в данном случае трансплантация осуществлялась в трансгенный хост-организм; визуализация дорсальной части головного отдела проводилась с помощью лазерного сканирования. Конфокальная микроскопия выявила флуоресцентно-красные кластеры донорских клеток среди GFP-положительных ядер в переднем мозге.

Далее мы проанализировали этот организм, собирая Z-стеки каждые три минуты в течение двух часов с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Четырехмерная визуализация этого таймлапса с использованием программного обеспечения Velocity, предоставленного IMP, демонстрирует динамические перемещения клеточных мембран доминантных клеток палочек и GFP-положительных ядер. Мы только что показали вам, как подготовить все необходимые приборы и реагенты для трансплантации клеток в эмбрионы zebrafish.

В частности, мы продемонстрировали данную методику на стадии гаструляции. Однако она также применима к трансплантациям на стадии бластулы. При использовании этой процедуры важно точно соотнести желаемое конечное положение трансплантированных клеток с их более ранним положением на карте развития этих клеток в гаструле; для получения более подробных указаний обратитесь к детальному исследованию карт развития зародыша данио-рерио 1995 года за авторством доктора Скотта Фрейзера под названием «Fate Maps of the Zebrafish Embryo».

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.