Эмбриональные ткани Целевые химерами: данио рерио Гаструла клеточной трансплантации

Данная процедура начинается с размещения эмбрионов zebrafish на стадии одной клетки в планшет для микроинъекций. В желток вводится раствор флуоресцентного декстрина с помощью микроинъекции. Эмбрионы, находящиеся непосредственно под клетками, в которые была произведена инъекция, являются донорами для трансплантации.

Покройте эмбрионы донора и реципиента и выращивайте их до стадии щита. Поместите два эмбриона, в которые был введен декстрин с покрытием DEC, рядом друг с другом в одну лунку планшета для трансплантации. Повторите процедуру для каждой пары доноров. Добавьте один эмбрион реципиента в каждую лунку, чтобы направить трансплантированные клетки в будущий диэнцефалон переднего мозга, перемещая клетки из средней линии и в неё.

На середине пути между анимальным полюсом и щитом. Пересадите клетки из донорской газы в газу реципиента. Вырастите до 30 часов и зафиксируйте.

При необходимости проведите иммунохимический анализ, затем зафиксируйте образец и выполните визуализацию. В качестве альтернативы можно зафиксировать живого хозяина и провести таймлапс-съемку. Здравствуйте, меня зовут Элизабет Де Шейн, я представляю лабораторию доктора Майкла Эси с кафедры биологических наук Смит-колледжа в Нортэмптоне, штат Массачусетс.

Меня зовут доктор Майкл Беси, я являюсь руководителем лаборатории. Сегодня мы продемонстрируем вам способ создания химерных эмбрионов путем трансплантации клеток на гаструляционной стадии с использованием модельной системы данио-рерио. В моей лаборатории эта процедура применяется для изучения функции специфических генов в развитии комиссуры переднего мозга, а также процессов аксонно-глиальных взаимодействий в ходе формирования комиссуры.

Итак, приступим. Для начала подготовьте желоба для пластин для микроинъекций, аккуратно разломив пополам три нефиламентных капилляра диаметром 1 мм и длиной 4 дюйма. С помощью суперклея приклейте две половины капилляров параллельно друг другу к плоской поверхности.

Третий капилляр помещают сверху на эти два, укладывая его в желобок так, чтобы получилась форма пирамиды. Оставьте форму с тремя капиллярами до полного высыхания. Для каждой инъекционной пластины следует изготовить от трех до пяти таких форм.

Затем подготовьте планшеты для инъекций, налив от 20 до 25 миллилитров расплавленного 1,5% агароза в среде для эмбрионов в чашку Петри диаметром 100 миллиметров. Немедленно поместите три-пять подготовленных форм для желобков на дно чашки, убедившись, что плоская сторона формы прилегает к дну чашки Петри и полностью покрыта агарозой. После затвердевания агарозы удалите формы для желобков, вырезав большой квадрат из агарозы, содержащий их.

Осторожно отделите агар по периферии вырезанного квадрата и удалите его. Переверните квадратный фрагмент агара и с помощью тонкого пинцета полностью удалите формы для лунок. Залейте расплавленный агар в чашку Петри вокруг квадрата, чтобы зафиксировать только что сформированные лунки на месте.

Оставьте для застывания. Плашки можно загерметизировать парафильмом и хранить в течение нескольких недель при температуре 4 °C. При появлении любых признаков роста в агаре их следует утилизировать.

Наконец, для подготовки инъекционных игл используйте вытягиватель капилляров микропипеток, чтобы изготовить иглы из четырехдюймовых стеклянных капилляров диаметром один миллиметр с внутренними нитями; после этого подготовьте планшет для микроинъекций и сами иглы. Перейдем к сбору эмбрионов и настройке аппарата для микроинъекций. Оплодотворенные яйца собирают сразу после откладки и содержат в чашке Петри, заполненной средой для эмбрионов.

С помощью стеклянной пипетки с широким наконечником перенесите эмбрионы в лунки планшета для инъекций, находящегося при комнатной температуре и заполненного средой для эмбрионов. Используя зажимные тупые пинцеты, осторожно прижмите эмбрионы к дну лунок; эмбрионы с поврежденной хориом или желтком следует удалить.

Затем наберите в инъекционную иглу от одного до двух микролитров разбавленного раствора флуоресцентного декстрина Alexa 594. Дайте декстрину переместиться к кончику инъекционной иглы за счет капиллярного эффекта. Закрепите инъекционную иглу в держателе капилляров стереотаксического микроманипулятора и предварительно настройте давление на аппарате микроинъектора.

давление от 40 до 50 PSI и длительность импульса 500 миллисекунд. С помощью пинцета осторожно поцарапайте или подрежьте кончик иглы для инъекций, чтобы вскрыть герметичный затвор. В идеале диаметр должен составлять от 0,05 до 0,15 миллиметра.

Для калибровки иглы используйте стереомикроскоп и вытесните декстрин на микрометр, покрытый сверху минеральным маслом. Изменяйте размер болюса, регулируя длительность импульса давления воздуха и размер иглы. Совет: на протяжении всех инъекций следует поддерживать размер болюса, эквивалентный объему от 0.8 до 1 нл.

Теперь можно приступить к микроинъекции декстрина, используя увеличение стереомикроскопа примерно 3,2x. Начинайте инъекции в эмбрионы с одного конца лотка, плавно прокалывая хорион и клеточную мембрану эмбрионов для введения иглы в желток. Вводите раствор декстрина непосредственно под клетку.

Убедитесь, что игла для инъекции извлечена тем же плавным движением, которое использовалось при введении в эмбрион. Переместите чашку Петри, чтобы расположить следующий эмбрион в очереди, и продолжайте проводить инъекции вдоль всей желобчатой подложки. Периодически проверяйте давление и размер болюса.

Теперь с помощью пинцета осторожно вытолкните эмбрионы из желобков. Перенесите их в чашку Петри, наполненную антибиотиком и средой для эмбрионов. Инкубируйте эмбрионы при температуре 28.5 °C и проверяйте их на наличие неоплодотворенных икринок или погибших особей.

Эмбрионы теперь готовы к последующей трансплантации. До завершения процесса полигастрации части желтка остаются открытыми. Желток крайне хрупок, он может прилипнуть к пластику чашки Петри и легко порваться.

Таким образом, эмбрионы необходимо разместить на подготовленных планшетах за день до проведения трансплантации. Для приготовления таких планшетов налейте от 5 до 10 мл расплавленного агароза в чашку Петри диаметром 100 мм. Для создания поддерживающего слоя под эмбрионами достаточно тонкого слоя агарозы толщиной около 2–3 мм.

Дайте чашкам остыть. Затем подготовьте отдельные чашки для пересадки, налив 30 миллилитров 1,5% раствора агарозы в чашку Петри диаметром 100 миллиметров, и вставьте форму для лунок пересадки. Форма должна содержать 104 треугольных углубления, каждое из которых состоит из трех сторон под углом 90 градусов и одной стороны под углом 45 градусов.

Лунки предназначены для размещения двух эмбрионов рядом друг с другом. Следите за тем, чтобы под формой не оставалось пузырьков воздуха, и дайте агарозе затвердеть. После снятия формы обнаружится углубление с квадратными лунками, имеющими скошенные края.

Для подготовки эмбрионов реципиента и донора к трансплантации необходимо контролировать их развитие, чтобы обеспечить максимально близкое соответствие по возрасту. Для этого эмбрионов можно выращивать при различных температурах от 23 до 31 °C, чтобы замедлить или ускорить развитие. И эмбрионы реципиента, и эмбрионы донора должны быть вручную перенесены на планшет с покрытием за один час до достижения требуемого возраста.

В случае трансплантации на стадии гаструляции процедуру необходимо завершить к пяти часам после оплодотворения (HPF) или до стадии щита на 5,5 HPF. С помощью стеклянной пипетки перенесите эмбрионы реципиента и донора в планшет для трансплантации, заполненный антибиотиками содержащей средой для эмбрионов. В данном случае первый ряд заполняется эмбрионами-донорами по два эмбриона на лунку, а следующие два ряда — одним эмбрионом-реципиентом на лунку.

Для проведения трансплантации мы используем флуоресцентный стереомикроскоп Zeiss luer с полностью автоматизированным управлением зумом и фокусировкой с помощью джойстика. Хотя использование такого автоматизированного микроскопа не является обязательным, оно значительно облегчает и повышает эффективность этих прецизионных хирургических трансплантаций, особенно когда требуется выполнить большое количество операций. Для подготовки аппаратуры для трансплантации установите воздушный трамвай einor в среднее положение его шкалы, подсоедините трубку воздушного трамвая к держателю капилляров и закрепите держатель на автоматическом микроманипуляторе einor. После подготовки эмбрионов и аппаратуры для трансплантации можно переходить к трансплантации клеток на стадии гаструлы.

Наиболее критически важным навыком при выполнении трансплантации клеток на стадии гаструляции является способность распознавать клеточную анатомию дорсальных бластомеров (APO lip), также известных как щит у zebrafish. Здесь мы представляем последовательность кадров гаструлы с разных ракурсов и указываем расположение щита при данном боковом обзоре. Щит или дорсальная сторона находится справа, отмечен красным контуром, чтобы определить клетки-мишени для трансплантации в передний мозг и к средней линии.

Ровно посередине между анимальным полюсом и щитом мы начнем вращать эмбрион сначала к вам, чтобы рассмотреть анимальный полюс, по пути выделяя щит и место трансплантации. Затем эмбрион вращается вокруг своей оси так, чтобы щит оказался внизу. После этого гаструла снова поворачивается вверх, обеспечивая прямой вид на дорсальную сторону.

Затем эмбрион последовательно поворачивают обратно до бокового вида на стадии 6 часов после оплодотворения (HPF). С помощью микроманипулятора осторожно коснитесь эмбриона кончиком капилляра, чтобы повернуть его в положение для экстракции клеток так, чтобы его срединная линия и щит были видны и находились напротив кончика капилляра; донорские эмбрионы легко идентифицировать, переключившись с яркого поля на флуоресцентное освещение. В данном случае клетки гаструлы флуоресцируют красным. Аспирируйте небольшое количество среды для эмбрионов в капилляр, чтобы исключить возможность контакта клеток с границей раздела воздух-вода, что могло бы их повредить.

Осторожно проколите эктодерму эмбриона-донора по срединной линии точно между анимальным полюсом и щитом. В области газовой камеры слой клеток между поверхностной эктодермой и лежащим под ней желтком составляет всего около 20 µm. Поэтому будьте осторожны, чтобы не проткнуть желток, так как это часто приводит к гибели эмбриона в течение нескольких часов.

С помощью воздушного насоса медленно аспирируйте клетки в капилляр. Постоянно контролируйте уровень воды, слегка встряхивая кончик. Нахождение внутри донора поможет ослабить межклеточные контакты.

Из эмбриона-донора следует извлечь примерно от 10 до 50 клеток. Затем извлеките капилляр из донора. Расположите эмбрион-реципиент аналогичным образом, проколите его и вытолкните клетки точно в то же место в эмбрионе-реципиенте; при переключении с освещения в светлом поле на флуоресцентное освещение становится видно перемещение меченных декстрином клеток из капиллярной иглы в эмбрион-реципиент.

Наконец, после трансплантации извлеките эмбрионы донора и реципиента из лунок. Разделите их и аккуратно поместите в чашку Петри с покрытием A, заполненную антибиотиком и средой для эмбрионов. Инкубируйте эмбрионы при 28.5 °C. На этом трансплантация завершена.

Перейдем к визуализации и получению изображений. Начинают с фиксации эмбрионов на соответствующей стадии развития с использованием консерванта, подходящего для иммунохимического анализа. В нашем случае фиксация проводится в 4% formaldehyde в течение двух часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C в условиях ротации.

После этого дважды промойте фиксированные эмбрионы, а затем выдержите их в 0,1 молярном pb в течение трех-пяти минут. При необходимости проведите соответствующее иммуномаркирование.

Поместите эмбрионы в 75% глицерин, погрузите их при комнатной температуре и храните при температуре четырех градусов Цельсия. Подготовьте предметное стекло для закрепления двух эмбрионов, создав на нем два квадратных контура из вазелина, соответствующих внутреннему диаметру квадрата. Положите покровное стекло рядом с эмбрионом и выполните все необходимые диссекции, чтобы обеспечить фронтальный вид переднего мозга.

Отделите передний мозг, произведя перпендикулярный разрез через средний мозг. Поместите эту ткань с минимальным количеством глицерина в вазелиновое масло. Правильно ориентируйте ткань в нужном положении и накройте образец покровным стеклом.

В качестве альтернативы для живых эмбрионов используйте метод закрепления на стекле в 0,75% растворе агарозы. С использованием чашек для культивирования с плоским дном, пока агароза не затвердела, с помощью вольфрамовой иглы поместите эмбрион в положение, подходящее для визуализации. Визуализация проводится как для фиксированных, так и для живых организмов-хозяев.

С помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica SP пять выполнялся сбор Z-стеков, после чего с использованием программного обеспечения velocity проводилась трех- или четырехмерная обрабобатка изображений для создания химерных эмбрионов, в которых определенная часть популяции астроглии отличается по генотипу или фенотипу. Мы применили многогранный подход, сочетающий использование трансгенных эмбрионов GFP, в которых маркированы астроглиальные клетки, с трансплантацией клеток на стадии гаструляции для специфического воздействия наших клонов на цефалон. Мы использовали карту судеб клеток гаструляции данио-рерио, чтобы селективно извлекать клетки по срединной линии на равном расстоянии от анимального полюса и щита.

Затем эти извлеченные клетки были пересажены в то же место хозяину дикого типа gasa, который затем выращивали до 30 HPF и подвергали иммуномаркированию всех аксонов в качестве ориентиров анатомии переднего мозга. В представленном здесь примере конфокальная визуализация одного эмбриона хозяина выявляет отдельные GFP-положительные клетки по всей цефалоне и цефалоне. Полная морфология этих GFP-положительных клеток может быть наблюдаема в данном клональном анализе, показывая, что большинство из этих клеток приобретают характерную морфологию радиальной глии, при которой сома расположена рядом с вентрикулярной зоной, а крупная терминальная ножка завершает радиальный отросток на поверхности пеликулы.

Трехмерная визуализация стека этих собранных оптических срезов четко показывает положение данных клеток относительно меченых аксонов. Другим широко используемым подходом для визуализации трансплантированных клеток является предварительное микроинъекционное введение флуоресцентного красителя для отслеживания клеточных линий в желток эмбриона дикого типа или трансгенного эмбриона GFP на стадии одной клетки. В данном примере мы вводили декстрин Alexa 594 в эмбрионы дикого типа.

На стадии одной клетки мы дали им развиться до стадии гаструлы, а затем провели четыре трансплантации в область мозга, как описано выше. Однако вместо этого мы пересадили их в трансгенных реципиентов на стадии гаструлы; визуализацию дорсального отдела головного мозга проводили с помощью лазерного сканирования. Конфокальная микроскопия выявила флуоресцентно-красные кластеры донорских клеток среди GFP-положительных ядер в переднем мозге.

Далее мы проанализировали этот хост, собирая Z-стеки каждые три минуты в течение двух часов с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Четырехмерная визуализация этого таймлапса с использованием программного обеспечения Velocity, предоставленного IMP, демонстрирует динамические клеточные перемещения мембран доминантных клеток палочек и GFP-положительных ядер. Мы только что показали вам, как подготовить всю необходимую аппаратуру и реагенты для трансплантации клеток в эмбрионы zebrafish.

В частности, мы продемонстрировали данную методику на стадии гаструляции. Однако она также применима к трансплантации на стадии бластулы. При использовании этой процедуры важно точно соотнести конечное желаемое положение трансплантированных клеток с их более ранним положением на карте судьбы этих клеток при гаструляции. Для получения дополнительных указаний обратитесь к подробному исследованию карт судьбы эмбриона данио-рерио, проведенному доктором Скоттом Фрейзером в 1995 году и озаглавленному «Fate Maps of the Zebrafish Embryo».

На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.