Быстро и чувствительной Коллоидное Кумасси G-250 для окрашивания белков в полиакриламидном геле

В данном видео мы продемонстрируем эффективность модифицированного протокола окрашивания кумасси для обнаружения нескольких нанограммов белка в полиакриламидных гелях. В качестве примера будет использован двухмерный гель-электрофорез, начиная с разделения в первом измерении. Полоски с иммобилизованным pH-градиентом регидратируют в условиях денатурирующего буфера.

После ночного набухания полосок образцы белков наносятся с помощью анодных чашечек. В процессе фокусировки белки разделяются в соответствии с их изоэлектрическими точками. Разделение во втором измерении осуществляется с помощью SDS-PAGE.

Затем гель переносят в кювету для окрашивания, и белки детектируют путем окрашивания коллоидным кумази. Здравствуйте, я Надин де Бала из лаборатории Сабины Мека в биомедицинском исследовательском центре Университета Олора. Сегодня я обращу ваше внимание на широко известную процедуру согласно коллегам Канган; Cy Brilliant Blue — это краситель, часто используемый для визуализации белков после электрофоретического разделения, но который часто считается менее применимым для сравнительной протеомики.

Однако коллоидное окрашивание Coomassie offers превосходные характеристики с точки зрения чувствительности, стоимости и практичности. В нашей лаборатории мы используем протокол окрашивания Coomassie почти для всех приложений на основе гелей, но особенно в аналитическом протеомике для определения изменений экспрессии белков миокарда. Я продемонстрирую использование этого метода для обнаружения белков миокарда в щелочном диапазоне pH гелей двумерного электрофореза.

Итак, приступим. Первым этапом двумерного гель-электрофореза является изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), для которого в данном анализе используются полоски с иммобилизованным pH-градиентом (IPG-полоски).

Перед проведением ИЭФ четыре полоски IPG индивидуально регидратируют в 125 мкл регидратирующего раствора с использованием лотка для набухания сухих полосок IM Mobilly в течение не менее 10 часов, после чего полоски IPG будут регидратированы и готовы к нанесению белковых образцов. Образцы белков четырех различных препаратов сердца, осажденных ТХА, растворяют в буфере для образцов ИЭФ до концентрации 100 мкг белка на 100 мкл. Солюбилизация белковых образцов проводится в течение не менее 30 минут при комнатной температуре на вортексе.

Тем временем подготовьте дополнительные компоненты набора сухих полосок IM Molene для проведения иЭФ в установке для многомерного электрофореза multi four. Сначала установите температуру охлаждающего устройства на 20 °C, нанесите пипеткой от 3 до 4 мл охлаждающей жидкости на охлаждающую пластину и поместите на неё лоток для сухих полосок Immobilien красным электродом в сторону анода. Налейте около 10 мл покрывающего масла в лоток для сухих полосок Immobilien и поместите выравниватель для сухих полосок Immobilien пазом вверх на заполненный маслом лоток.

Затем извлеките регидратированную полоску из лотка для набухания и перенесите ее гелевой стороной вверх в пазы выравнивателя. Кислый конец полоски должен быть направлен к аноду. В итоге все полоски должны быть выровнены своими анодными краями.

Поместите полоски электродов, насыщенные дистиллированной водой, поперек концов гелевых полосок, убедившись, что полоски электродов хотя бы частично контактируют с поверхностью геля. В завершение установите электроды на полоски электродов так, чтобы цветная метка была направлена к соответствующему электронному контакту. Разместите держатель кювет для образцов рядом с анодом в лотке для сухих иммобилизованных полосок и установите кювету с образцом над каждой полоской IPG.

Осторожно прижмите чашечки для образцов, чтобы обеспечить хороший контакт с полоской IPG. Налейте в кювету от 70 до 80 миллилитров покровного масла, чтобы полностью покрыть полоски IPG. Масло не должно попадать в чашечки для образцов.

Если масло попало в кюветы, удалите его с помощью пипетки и заново отрегулируйте положение кювет. В завершение добавьте около 150 миллилитров покровного масла, чтобы полностью заполнить пространство над кюветами с образцами. Теперь внесите образцы белка в кюветы, используя пипетку, вводя жидкость под поверхность покровного слоя.

Объем кюветы составляет 100 мкл. После нанесения всех образцов белка подключите все электроды. Подключите блок MultiFour к источнику питания и проведите изоэлектрическое фокусирование в градиентном режиме до достижения 11,1 кВ·ч. После IEF полоски IPG помещают в лоток гелевой стороной вверх и подвергают восстановлению и алкилированию в процессе уравновешивания.

Для восстановления используйте 2,5 milliliters 1% DI three et all уравновешивающего раствора на одну полоску. После этого перемешивайте в течение 15 minutes, затем полностью замените раствор DTT и проведите алкилирование полосок в 2,5% I oto acetamide уравновешивающем растворе при перемешивании еще в течение 15 minutes. Один раз промойте уравновешенные полоски в стакане с водой и промокните их фильтровальной бумагой, чтобы удалить излишки уравновешивающего буфера.

Затем перенесите полоски в один буфер для электрофореза XSDS. Белки в полосках теперь готовы ко второму измерению двухмерного электрофореза в геле. Второе измерение выполняется методом SDS-PAGE с использованием вертикальной системы электрофореза.

За один день до использования готовят необходимое количество гелей с 12% акриламидом толщиной 1 мм, которые хранят под влажной бумагой. При комнатной температуре уравновешенные полоски IPG помещают на поверхность разделяющих гелей и фиксируют горячим агарозным раствором. Белки разделяют в течение 2,5 часов, начиная с 80 вольт в течение 15 минут, с последующим увеличением до 120 вольт до тех пор, пока фронт красителя не достигнет нижней части кассеты с гелем.

Пока белки разделяются с помощью SDS-PAGE, приготовьте растворы для коллоидного окрашивания кумази геля. При приготовлении окрашивающего раствора крайне важно соблюдать последовательность добавления компонентов в следующем порядке. Сначала растворите 100 г сульфата алюминия в примерно 1,5 л воды Milli-Q в стакане и перемешайте. После растворения сульфата алюминия добавьте 200 мл этанола и 0,4 г CBB G-250 в раствор.

Как только CBB G two 50 полностью растворится, добавьте 47 миллилитров ортофосфорной кислоты. Этот этап позволяет молекулам кумасси агрегировать в коллоидное состояние. В завершение добавьте воду Milli-Q до конечного объема два литра.

В конечном полученном растворе будут плавать частицы. Не фильтруйте этот раствор. Раствор для окрашивания также можно приготовить заранее и хранить в темном месте до использования.

По завершении электрофореза в SDS-геле осторожно извлеките гель из стеклянных пластин и перенесите его в кювету для окрашивания, наполненную водой Milli Q. Поместите кювету с гелем на горизонтальный шейкер и встряхивайте в течение 10 минут.

Повторите промывку еще два раза, по 5–10 минут. Важно тщательно промыть гель свежей водой Milli-Q, так как остаточный SDS на геле может нарушить связывание красителя с белком и привести к низкой чувствительности. По окончании третьей промывки слейте воду из кюветы.

Теперь гель готов к окрашиванию. Сначала встряхните раствор кумасси, чтобы равномерно распределить коллоидные частицы. Затем добавьте достаточное количество раствора, чтобы полностью покрыть гель.

Поместите чашку с раствором Кумаси в закрытом виде вместе с гелем на шейкер и перемешивайте от 2 до 12 часов. Через 10 минут начнут появляться первые белковые пятна.

От 80 до ста процентов окрашивания может быть достигнуто в течение двух часов инкубации. Однако для достижения почти 100% окрашивания мы рекомендуем инкубацию в течение ночи. По завершении окрашивания удалите раствор Комасси и дважды промойте гель водой Milli Q.

После промывки геля удалите частицы красителя, прилипшие к кювете для окрашивания, безворсовой бумажной салфеткой. Добавьте в гель раствор для обесцвечивания и оставьте на 10–60 минут на шейкере. В завершение дважды промойте гель водой Milli Q.

Гель вернет свою первоначальную толщину, а интенсивность окрашивания кумаси также усилится. При соблюдении данного протокола ваши 2D-гели должны иметь четкое разрешение и хорошее окрашивание с темно-синими белковыми пятнами. Результат нашего окрашивания 2D-гелей кумаси сопоставим с результатом окрашивания серебром.

Согласно протоколу Chenko и др., который характеризуется высокой чувствительностью и совместимостью с масс-спектрометрией. На примере двумерного электрофореза в геле мы продемонстрировали, насколько быстро, просто и чувствительно окрашивание кумасси. Окрашивание для детектирования белков в полиакриламидных гелях может быть завершено в течение двух часов.

Сама процедура требует минимальных трудозатрат. И, что немаловажно, вы сможете обнаружить даже один нанограмм белка. Таким образом, данный протокол определенно является хорошей альтернативой методам безмаркерной протеомики на основе гель-электрофореза.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использования химических реагентов аналитической чистоты и воды наивысшей степени очистки. Кроме того, критически важным этапом подготовки является последовательное добавление компонентов в окрашивающий раствор. Наконец, не забудьте тщательно вымыть остатки SDS из гелей после электрофоретического разделения.

В противном случае на ваших гелях ничего не будет видно. На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.