Быстро и чувствительной Коллоидное Кумасси G-250 для окрашивания белков в полиакриламидном геле

В этом видео мы продемонстрируем возможности модифицированного протокола окрашивания кумаси для обнаружения нескольких нанограммов белка в полиакриламидных гелях. На примере двумерного гель-электрофореза перед разделением первого измерения. Иммобилизованные полоски градиента pH регидратируются в условиях денатурирующего буфера.

После повторного набухания полосок в течение ночи образцы белка наносятся с помощью загрузки анодной чашки. В процессе фокусировки белки разделяются в соответствии с их изоэлектрическими точками. Разделение по второму измерению осуществляется по странице SDS.

Затем гель переносят в чашку для окрашивания, а белки обнаруживают путем окрашивания коллоидными кумаси. Здравствуйте, я Надин де Бала из лаборатории Сабины Мека в биологическом медицинском исследовательском центре Университета Олор. Сегодня я обращу ваше внимание на широко известную по мнению коллег из Кангана процедуру, Cy Brilliant Blue — это дайка, обычно используемая для визуализации белков после электрофоретического разделения, но часто считающаяся менее применимой для сравнительной протеомики.

Тем не менее, коллоидное окрашивание обладает превосходными характеристиками в отношении чувствительности, стоимости и практичности. Мы используем протокол окрашивания K в нашей лаборатории для почти обычного нанесения на основе геля, но особенно в аналитической протеомике для определения изменений экспрессии белка миокарда. Я продемонстрирую использование этого метода для обнаружения белков миокарда в щелочном диапазоне pH двумерных гелей для электрофореза.

Итак, приступим. Понятно. Первым измерением 2D гель-электрофореза является изоэлектрическая фокусировка или IEF, и для этого анализа используются иммобилизованные полоски с градиентом pH или полоски IPG.

Перед проведением IEF четыре полоски IPG регидратируются по отдельности в 125 микролитрах раствора для регидратации с использованием лотка для набухания сухой полоски IM Mobilly в течение не менее 10 часов, когда полоски IPG регидратированы и готовы к нанесению образца белка. Осажденные образцы белка ТСА из четырех различных сердечных препаратов растворяют в буфере для образцов IEF до концентрации белка 100 микрограммов на 100 микролитров. Солюбилизация образцов белка займет не менее 30 минут при комнатной температуре на вихре.

Тем временем подготовьте дополнительные компоненты комплекта сухой полоски IM Molene для выполнения ВЭФ в блоке электрофореза multi four. Сначала установите температуру охлаждающего устройства на уровне 20 градусов Цельсия, нанесите три-четыре миллилитра покровной жидкости на охлаждающую пластину и поместите на нее лоток для сухих полосок Immobilien с красным электродным соединением по направлению к аноду. Налейте около 10 миллилитров покровного масла в лоток для сухих полос Immobilien и поместите выравниватель сухих полос Immobilien стороной канавки вверх на поддон, покрытый маслом.

Затем извлеките регидратированную полоску из лотка для повторного набухания и перенесите ее гелевой стороной вверх к канавкам элайнера. Кислотный конец полоски должен быть обращен в сторону анода. В конце все полосы должны быть выровнены по своим анодным краям.

Поместите пропитанные дистиллированной водой электродные полоски сбоку на концах гелевых полосок, следя за тем, чтобы электродные полоски хотя бы частично соприкасались с поверхностью геля. Наконец, расположите электроды на электродных полосках так, чтобы цветная метка была направлена в сторону соответствующего электронного контакта. Расположите стержень чашки для образца рядом с анодом на лотке для сухой полоски иммобилиен и поместите чашку для образца над каждой полоской IPG.

Осторожно прижмите чашки для образцов, чтобы обеспечить хороший контакт с полоской IPG. Налейте в противень от 70 до 80 миллилитров покровного масла, чтобы покрыть полоски IPG. Масло не должно просачиваться в чашки для образцов.

Если масло попало в чашку, извлеките ее с помощью пипетки и снова отрегулируйте чашки. Наконец, добавьте около 150 миллилитров покровного масла, чтобы полностью покрыть чашки для образцов. Теперь нанесите образцы белка в чашки для образцов, пипетируя под поверхностью покровной жидкости.

Объем чашки составляет 100 микролитров. После того, как все образцы белка будут нанесены, подключите все провода. Подключите блок мульти четыре к источнику питания и выполните изоэлектрическую фокусировку в течение 11,1 киловольт-часов в градиентном режиме, после IEF полоски IPG помещаются в лоток гелевой стороной вверх и подвергаются восстановлению и алкилированию во время балансировки.

Для снижения используйте 2,5 миллилитров 1%-ного раствора DI три и все уравновешивающие растворы на полоску. После этого встряхните в течение 15 минут, а затем полностью замените раствор DTT и алкилируйте полоски в 2,5%I растворе для уравновешивания ацетамида с встряхиванием еще 15 минут. Промойте уравновешивающие полоски один раз в стакане, наполненном водой, и промокните их на фильтровальной бумаге, чтобы удалить излишки уравновешивающего буфера.

Далее перенесите полоски в один рабочий буфер XSDS. Белки в полосках теперь готовы ко второму измерению 2D-гель-электрофореза. Второе измерение выполняется с помощью страницы SDS на системе вертикального электрофореза.

Соответствующее количество 12% акриламидных гелей толщиной в один миллиметр отливают за один день до использования и хранят накрытым влажной бумагой. При комнатной температуре уравновешенные полоски IPG помещаются на верхнюю часть разделительных гелей и фиксируются горячим агрораствором для каждого белка в течение 2,5 часов, начиная с 80 вольт в течение 15 минут, а затем 120 вольт до тех пор, пока фронт красителя не достигнет дна гелевой кассеты.

Пока белки отделяются с помощью SDS, приготовьте растворы для окрашивания коллоидной кумаси в геле. При изготовлении окрашивающего раствора очень важно выдержать последовательное добавление компонентов в следующем порядке. Сначала растворите в стакане 100 граммов сульфата алюминия и примерно 1,5 литра кубической воды и перемешайте После того, как сульфат алюминия растворится, смешайте 200 миллилитров этанола и добавьте в раствор 0,4 грамма CBG two 50.

Как только CBB G two 50 полностью растворится, добавьте 47 миллилитров ортофосфорной кислоты. Этот этап позволяет молекулам камаси агрегировать в свое коллоидное состояние. Наконец, добавьте воду milli Q до конечного объема в два литра.

В окончательном стоячем растворе будут плавать частицы. Не фильтруйте этот раствор. Раствор для окрашивания также можно приготовить заранее и хранить в темноте до использования.

Когда гель SDS будет готов. Осторожно снимите гель со стеклянных пластин и переложите его в форму для окрашивания, наполненную водой Milli Q. Поставьте форму с гелем на горизонтальный шейкер и встряхивайте в течение 10 минут.

Повторите стирку еще два раза в течение примерно пяти-10 минут. При использовании свежей воды в милликубах важно хорошо смыть гель, потому что оставшийся SDS на геле может нарушить связывание красителя с белком и вызвать плохую чувствительность. В конце третьего мытья вылейте воду из посуды.

Теперь гель готов к окрашиванию. Сначала встряхните раствор Кумаси, чтобы коллоидные частицы равномерно распределились. Затем добавьте достаточное количество раствора, чтобы покрыть гель.

Поставьте тарелку с раствором Кумаси под крышку. Нанесите гель на шейкер и помешивайте от двух до 12 часов. Через 10 минут вы заметите появление первых белковых пятен.

От 80 до 100 процентов окрашивания может быть достигнуто в течение двух часов после инкубации. Но мы рекомендуем проводить ночную инкубацию для достижения почти 100% окрашивания. Когда окрашивание будет завершено, удалите раствор Камаси и дважды смойте гель водой Milli Q.

После полоскания геля удалите прилипшие частички красителя с посуды для окрашивания безворсовым бумажным полотенцем. Добавьте в гель раствор для окрашивания и задержите на шейкер от 10 до 60 минут. Наконец, дважды смойте гель водой Milli Q.

Гель восстановит свою первоначальную густоту, а интенсивность цвета пятна кумаси также будет увеличена. Если вы следуете этому протоколу, ваш 2D-гель должен быть отчетливо растворен и хорошо окрашен темно-синими белковыми пятнами. Результат нашего окрашивания кумаси 2D гелями сравним с результатом окрашивания серебром.

Согласно протоколу Chef Chenko et al, который, как сообщается, обладает высокой чувствительностью и совместимостью с масс-спектрометрией. На примере двумерного гелевого электрофореза мы только что показали вам, насколько быстрым, простым и чувствительным является поддержание канг-кумы. Для выявления белков в поакриламидных гелях выдерживание может быть завершено в течение двух часов.

Сама процедура не требует больших трудозатрат. И последнее, но не менее важное: вы можете обнаружить всего один нанограмм белка. Так что этот протокол определенно является хорошей альтернативой методам разметки протеомики, основанной на тюрьме.

Когда вы используете поддерживающую процедуру, важно помнить об использовании аналитических химикатов и воды высочайшей чистоты. Кроме того, последовательное добавление компонентов в окрашивающий раствор является критически важным этапом приготовления. Наконец, не забывайте эффективно промывать остатки SDES из гелей после электрофоретического разделения.

В противном случае вы ничего не увидите на своих гелях. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.