Получение высокого качества РНК от единичных клеточных популяций в тканях человека Мозг Посмертные

Данная процедура начинается с изготовления срезов толщиной 8 мкм из блоков ткани, замороженных в парах жидкого азота, на криостате, установленном на температуру -17 °C, на обычные незаряженные предметные стекла. Затем срезы окрашивают с помощью набора для гистогенетического окрашивания. После идентификации пирамидных нейронов около 500 клеток захватывают с помощью лазерной микродиссекции на колпачок HS capture cap.

Колпачок с клетками помещают в микроцентрифужную пробирку, содержащую 50 µL экстракционного буфера, переворачивают вверх дном и помещают в пробирку Falcon, предварительно установленную в штатив в водяной бане при температуре 42 °C. После короткого центрифугирования колпачок извлекают. Оставшийся раствор готов к выделению RNA.

Здравствуйте, я Шармейн Питерсон из лаборатории Уилсона Ву факультета структурной и молекулярной нейробиологии госпиталя Маклин. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру лазерного микрозахвата параметальных нейронов из посмертных тканей головного мозга человека. В нашей лаборатории мы используем эту процедуру для изучения дифференциальной экспрессии генов в верхней височной извилине и извилине поясной коры у субъектов с шизофренией с помощью технологии микрочипов.

Итак, приступим. Образцы тканей мозга были получены из Гарвардского центра ресурсов тканей мозга (Harvard Brain Tissue Resource Center) в виде блоков, замороженных в парах жидкого азота, перед началом секционирования. Для минимизации контаминации РНК все поверхности, включая рабочую зону, лезвие микротома и предметные стекла, обрабатывают раствором для деконтаминации РНК, таким как RNA SAP, и протирают 100% ethanol.

Данная процедура начинается с изготовления срезов блоков ткани, замороженных парами жидкого азота, на криостате, установленном на температуру -17 °C, на обычные незаряженные предметные стекла. Полученные срезы ткани готовы к идентификации пирамидных нейронов с использованием набора для экспресс-окрашивания Histo Gene. Подготовьте серию для дегидратации в этаноле, налив по 25 мл этанола соответствующей концентрации и воды, свободной от РНК, в стаканы для окрашивания, входящие в состав набора Histo Gene.

Поместите все баночки в ведерко со льдом, за исключением одной баночки с 75% ethanol. Эту баночку с 75% ethanol поместите в морозильную камеру при температуре -20 °C. Затем приготовьте окрашивающий раствор, добавив 1 µL ингибитора РНКас на каждые 100 µL окрашивающего раствора.

Поскольку мы будем окрашивать четыре среза ткани на двух предметных стеклах, в микроцентрифужную пробирку к 400 µL окрашивающего раствора добавляют 4 µL ингибитора РНКаз. Держите окрашивающий раствор на льду. Работать в вытяжном шкафу.

Добавьте молекулярные сита в банку с ксилолом для удаления избыточной воды, которая может привести к отслоению ткани. Включите водяную баню, установив температуру 42 °C, и поместите в нее пробирку Falcon объемом 50 мл, зафиксированную в штативе. Извлеките два предметных стекла из морозильной камеры при температуре -80 °C и разморозьте их на салфетке Kimwipe.

В течение примерно 30 секунд или до тех пор, пока углы предметных стекол не начнут оттаивать, проведите краткую фиксацию ткани в 75% ethanol в течение 30 секунд в морозильной камере при -20 °C. Затем, используя пинцет, не содержащий РНК, перенесите стекла в nuclease free water для промывки в течение 30 секунд. После промывки стекол обведите срезы маркером PAP barrier pen, чтобы сконцентрировать окрашивающий раствор на срезе, и окрасьте четыре среза раствором histo gene staining solution в течение 20 секунд. При использовании 97 µL красителя/ингибитора РНКазы на срез проведите дегидратацию срезов в предварительно подготовленном ethanol на льду по 30 секунд на каждом этапе.

Заключительный этап обработки 100% этанолом следует продлить до трех минут, чтобы достичь достаточного обезвоживания для надлежащего отслоения ткани. Затем погрузите предметные стекла в ксилол на пять минут и дайте им полностью высохнуть на воздухе перед началом лазерной захватывающей микродиссекции; пирамидные нейроны должны быть удалены сразу после окрашивания в ходе процедуры лазерного захвата единичных клеток. МИКРОДИССЕКЦИЯ или LCM требует использования водяной бани при 42 °C, в которой находится пробирка Falcon объемом 50 мл, закрепленная на подставке, которая была подготовлена ранее.

LCM одиночных клеток выполняется с использованием системы и программного обеспечения для лазерного захвата ARCTURUS XT. Для начала процедуры установите предметные стекла и колпачки в аппарат arcturus XT. Используйте колпачки capture HS, однако в настройках программы оставьте режим macro.

Нажмите на поле load with overview, чтобы получить обзорное фото каждого слайда. Отрегулируйте яркость и фокус при двухкратном увеличении (2x), чтобы определить оптимальный участок для лазерного захвата. Избегайте срезов ткани с избыточными складками; выбирайте интактные, гладкие и окрашенные срезы.

Наденьте колпачок на область, в которой будет производиться захват, убедившись, что в него попадает целевая зона — в нашем случае это третий слой коры. Убедитесь, что направляющие колпачка не опираются на какие-либо складки, так как это приведет к перекосу колпачка и, как следствие, к изменению размера пятен.

Затем вручную подтвердите положение пятна ИК-лазера при 40-кратном увеличении. Синий перекрестие должно быть центрировано относительно пятна ИК-лазера. Если это не так, скорректируйте его положение, щелкнув правой кнопкой мыши по пятну и выбрав «located IR spot».

При 40-кратном увеличении идентифицируйте пирамидные нейроны по следующим критериям: во-первых, клетки должны иметь пирамидальную форму, а во-вторых, должны быть определимы проксимальные отделы апикальных и/или базальных дендритов. Сохраните положение колпачка, нажав знак плюса в функции позиционирования. Таким образом, если колпачок будет смещен, он всегда вернется точно в то место, для которого вы настроили размер пятна.

Введите эти значения в окно управления: 70 в поле мощности и 16 в поле длительности. Поскольку данные параметры специфичны для нашего типа ткани, мы рекомендуем протестировать и скорректировать эти переменные в соответствии с вашим конкретным образцом ткани перед началом работы. При лазерном захвате одиночных клеток снимите флажок с опции автоматического перемещения столика и убедитесь, что символ размера соответствует символу на панели справа.

Выберите опцию в виде круга в правом нижнем углу, чтобы выбрать нейрон, захват которого вы хотите протестировать. После совмещения синего перекрестия с кругом активируйте лазер, нажав на кнопку test IR spot. Пятно, создаваемое лазером, сначала должно иметь четкое темное кольцо вокруг захваченного объекта.

Убедитесь, что кольцо достаточно велико, чтобы охватить клетку, но достаточно мало, чтобы в него не попали нежелательные ткани или другие клетки. Если кольцо слишком светлое, значит, клетка не была захвачена. Если в центре темного кольца наблюдается темное пятно, значит, мощность или длительность импульса лазера слишком высоки.

Повторите этот процесс на различных участках ткани внутри слоя, который необходимо захватить. Чтобы убедиться, что размер пятна не меняется в зависимости от расположения, внесите соответствующие коррективы. Выберите для захвата примерно 500 пирамидных нейронов.

Нажмите кнопку лазерного захвата для сбора клеток. Переместите колпачок на станцию контроля качества. Убедитесь, что было удалено не менее 90% нейронов.

Если этого не произошло, захватите больше клеток в той области, где было захвачено большинство клеток. Поместите колпачок в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 milliliter, содержащую 50 microliters экстракционного буфера. Конструкция колпачка обеспечивает плотное прилегание для предотвращения утечки буфера.

Переверните конструкцию вверх дном, убедившись, что экстракционный буфер полностью покрывает крышку, и поместите ее на дно 50 мл пробирки Falcon в водяной бане, установленной на 42 °C. Инкубируйте нейроны в течение 30 минут, чтобы отделить ткань от крышки; после инкубации центрифугируйте пробирку вместе с крышкой в течение двух минут при 800 ×g. После центрифугирования снимите крышку.

Если выделение РНК будет проводиться позже, храните оставшийся клеточный экстракт при температуре -80 °C. В противном случае приступайте к выделению РНК из клеточного экстракта, как показано в следующем разделе; выделение РНК осуществляется с помощью набора PICO Pure, который предназначен для выделения РНК из небольшого количества клеток в образцах LCM и сохранения мало представленной мРНК.

Для начала данной процедуры добавьте 70% ethanol, входящий в состав набора, к клеточному экстракту и центрифугируйте его на предварительно подготовленной очистительной колонке. Чтобы связать РНК с фильтром колонки после промывки, обработайте РНК с помощью D Ns для устранения риска интерференции ДНК. Этот этап особенно важен для последующих приложений, таких как ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией.

После расщепления ДНК добавьте 40 µL промывочного буфера 1 и центрифугируйте колонку для очистки в течение 15 секунд при 8,000 ×g. Далее выполните промывки в соответствии с протоколом, прилагаемым к набору, однако увеличьте время последнего этапа промывки буфером 2 с двух до двух с половиной минут, чтобы убедиться в полном удалении промывочного буфера из колонки, так как его остатки могут снизить выход РНК. Перенесите колонку в другую микроцентрифужную пробирку. Добавьте элюирующий буфер и инкубируйте его на фильтре в колонке в течение одной минуты, затем центрифугируйте колонку для элюции РНК.

Наконец, проверьте качество экстрагированной РНК с помощью чипа Experian High Sense, который обеспечивает получение виртуального геля и электрофореграммы; донесите пипеткой 1.3 µL образца в пробирку объемом 0.5 mL. Для проведения контроля качества заморозьте оставшуюся часть образца при температуре -80 °C. После подтверждения качества РНК ее можно амплифицировать, метить и гибридизовать.

Для анализа профилирования экспрессии генов будет проведено два раунда линейной амплификации с использованием набора ribo amp HS plus, что должно обеспечить получение примерно 50 micrograms амплифицированной РНК, достаточного количества для проведения как микрочипового анализа, так и экспериментов Q-R-T-P-C-R. Для мечения амплифицированной РНК используется набор turbo biotin labeling kit и реагенты для мечения от Molecular Devices. В завершение будет выполнено профилирование экспрессии генов с использованием биочипа human X three P gene chip pro beret от Agilent.

В результате секционирования ткани должно получиться два предметных стекла с двумя срезами на каждом, что в сумме составляет четыре среза на один случай. Каждый срез должен быть ровным, с минимальным количеством разрывов, трещин или складок. Пирамидные нейроны должны быть интенсивно окрашены, иметь размер около 20–25 µm, пирамидную форму и видимые апикальные дендриты.

В процессе LCM, после того как лазерный импульс проходит сквозь термопластичную пленку, клетки прилипают к колпачку и отделяются от предметного стекла, оставляя окружающую ткань. При использовании колпачков для захвата HS с макронастройками и правильной регулировкой мощности и интенсивности лазера к колпачку должны прикрепиться примерно от 85 до 100% нейронов. Для каждого среза следует получить около 500–700 клеток, что в итоге обеспечит получение не менее 500 пикограмм общей РНК на один случай.

После выделения тотальной РНК качество РНК оценивают с помощью электрофореграммы и виртуального геля на системе BioRad Experian. На электрофореграмме образцов посмертных тканей должны быть видны два четких пика, соответствующих рибосомальным РНК 18 S и 28 S. Однако это происходит не всегда, так как ткань может быть деградирована под воздействием факторов, предшествующих секционированию.

Обычно вы увидите выраженный подъем, указывающий на деградацию, с большим пиком около 18 s и меньшим пиком 28 s, на которые указывают красные стрелки. Напротив, РНК плохого качества с избыточной деградацией будет характеризоваться электроферограммой с большой площадью под кривой. Для проверки качества мРНК после двух раундов линейной амплификации, помимо смещения распределения вниз, мы используем как стандартный чип BioRad Experian Sense lab, так и спектрофотометр NanoDrop.

Традиционная технология микрочипов Atrics требует, чтобы длина распространения транскриптов мРНК составляла не менее 600 нуклеотидов для их обнаружения с помощью данного протокола. Распространение мРНК достигло диапазона 1000 нуклеотидов, что подтверждается электрофореграммой с крупными пиками, медленно снижающимися в зависимости от времени. Этот результат также подтверждается виртуальным гелем.

Если длина транскриптов составляет менее 600 нуклеотидов, образец не следует включать в анализ. Для гибридизации показатели NanoDrop продемонстрировали среднее соотношение 260/280 или степень чистоты 2,5 по всем образцам. Средняя концентрация составила 1,7 µg/µL, что обеспечило получение примерно 50 µg мРНК на образец; этого количества достаточно как для анализа на микрочипах, так и для последующей валидации результатов с помощью количественной RT-PCR, для которой требуется от 15 до 20 µg мРНК. Наши результаты показывают, что при использовании данного протокола количество и качество полученной РНК достаточно высоки для исследования различий в экспрессии генов с помощью чипа Atrix Human X3P.

После гибридизации с чипом Atrics Human X three P мы получили средний процент вызовов 26,6%, что указывает на адекватную гибридизацию и интенсивность зондов. Мы только что продемонстрировали вам способ лазерного захвата параметальных нейронов из посмертных тканей головного мозга человека для использования РНК, полученной из этих клеток. При выполнении данной процедуры для исследований профилирования микрочипов крайне важно проводить все этапы в среде, свободной от РНКаз, и соблюдать временные рамки для сохранения целостности РНК.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.