Получение высокого качества РНК от единичных клеточных популяций в тканях человека Мозг Посмертные

Мы опишем процесс с использованием лазерного захвата микродиссекции, чтобы изолировать и экстракта РНК из однородной популяции клеток, пирамидных нейронов в слое III в верхней височной извилины в посмертных человеческий мозг. Впоследствии мы линейно усиливать (T7-основе) мРНК, и гибридизации образца Affymetrix человека X3P микрочипов.

Эта процедура начинается с разрезания восьмимикрометровых блоков замороженных паров жидкого азота на криостате, установленном при температуре минус 17 градусов Цельсия, на обычные незаряженные стеклянные предметные стекла. После этого срезы окрашиваются с помощью набора для окрашивания гена histo. После идентификации пирамидальных нейронов клетки около 500 захватываются лазером на колпачке HS.

Колпачок с ячейками помещается в микроцентрифужную пробирку, содержащую 50 микролитров экстракционного буфера, перевернутую вверх дном и помещенную в ранее находившуюся в Ираке пробирку Falcon, сидящую на водяной бане, установленной на 42 градуса Цельсия. После короткого этапа центрифугирования крышка снимается. Оставшийся раствор после этого готов к выделению РНК.

Здравствуйте, я Шармейн Петерсон из лаборатории Уилсона Ву в отделении структурной и молекулярной нейробиологии больницы Маклина. Сегодня мы покажем вам процедуру лазерного захвата параметаллических нейронов из посмертной ткани мозга человека. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения дифференциальной экспрессии генов у вышестоящих и бедных извилин у пациентов с шизофренией с использованием технологии микрочипов.

Итак, приступим. Ткани мозга были получены из Гарвардского ресурсного центра тканей мозга в виде замороженных блоков паров жидкого азота перед срезом ткани. Важно снизить загрязнение РНК Все поверхности, включая рабочую зону, лезвие для секции и салазки обрабатываются раствором для обеззараживания РНК, таким как РНК SAP, и протираются 100% этанолом.

Эта процедура начинается с разрезания блоков замороженных тканей на криостате, установленном при температуре минус 17 градусов Цельсия, на обычные незаряженные стеклянные предметные стекла. Теперь срезы тканей готовы для идентификации пирамидальных нейронов с помощью набора для быстрого окрашивания гистогенов. Приготовьте серию дегидратации этанола в 25 миллилитров соответствующих концентраций этанола и свободную от РНК воду в красящие банки, прилагаемые к набору гистогенов.

Поместите все банки в ведро со льдом, за исключением одной банки с 75% этанолом. Поместите этот 75% этанол в морозильную камеру при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Далее приготовьте окрашивающий раствор, добавив один микролитр ингибитора РНК на 100 микролитров окрашивающего раствора.

Поскольку мы будем окрашивать четыре среза ткани на двух предметных стеклах, к 400 микролитрам раствора для окрашивания в микроцентрифужной пробирке добавляется четыре микролитра ингибитора РНК. Держите раствор для окрашивания на льду. Под вытяжным шкафом.

Добавьте молекулярные сита в банку с ксилолом, чтобы удалить лишнюю воду, которая может нарушить лифтинг тканей. Включите водяную баню с температурой 42 градуса Цельсия и поместите в водяную баню 50-миллилитровую трубку Falcon, поддерживаемую решеткой. Достаньте две горки из морозилки при температуре минус 80 градусов по Цельсию и разморозьте их на салфетке Кима.

Примерно на 30 секунд или только до тех пор, пока углы предметных стекол не начнут размораживаться, кратковременно зафиксируйте салфетку в 75% этаноле на 30 секунд в морозильной камере при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Затем с помощью щипцов, свободных от РНК, перенесите предметные стекла в воду, не содержащую нуклеаз, для 32-й промывки После промывки стекол обведите срезы барьерной ручкой PAP, чтобы сконцентрировать окрашивающий раствор на срезе Окрашивайте четыре секции раствором окрашивания гистогена в течение 20 секунд. С помощью 97 микролитров ингибитора РНК окрашивания на секцию обезвоживают участки в предварительно приготовленном этаноле на льду в течение 30 секунд за один шаг.

Заключительный этап 100% этанола должен быть продлен до трех минут для достижения достаточного обезвоживания для адекватного лифтинга тканей. Наконец, погрузите предметные стекла в ксилол на пять минут, дав им полностью высохнуть на воздухе, прежде чем приступить к микродиссекции лазерного захвата, пирамидальные нейроны должны быть немедленно удалены после окрашивания процедуры лазерного захвата одиночных клеток. Для микродиссекции или LCM требуется водяная баня с температурой 42 градуса Цельсия, содержащая 50-миллилитровую трубку Falcon с опорой на 50 миллилитров, которая была установлена ранее.

Одноклеточная LCM выполняется с помощью лазерной системы захвата и программного обеспечения ARCTURUS XT. Чтобы начать эту процедуру, загрузите слайды и колпачки на аппарат arcturus XT. Используйте колпачки захвата HS, но оставьте настройку программы на макросе.

Нажмите на блок загрузки с обзором, чтобы получить обзорную фотографию каждого слайда. Отрегулируйте фокус яркости при двукратном увеличении, чтобы определить оптимальную секцию для лазерного захвата. Избегайте участков ткани с чрезмерным складыванием, но выбирайте участки, которые не повреждены, гладкие и с пятнами.

Ну, наденьте колпачок на общую область, где вы будете снимать, убедившись, что в нашем случае она включает область, которую нужно захватить. Третий слой коры головного мозга. Убедитесь, что направляющие крышки не опираются на складки, так как это приведет к наклону крышки, что приведет к переменным размерам пятна.

Далее подтвердите расположение ИК-лазерного пятна вручную при 40-кратном увеличении. Синий крест должен быть центрирован в инфракрасном лазерном пятне. Если нет, измените его местоположение, щелкнув правой кнопкой мыши по пятну и выбрав расположенное ИК-пятно.

При 40-кратном увеличении определите пирамидальные нейроны в соответствии со следующими критериями: во-первых, можно идентифицировать клетки нашей пирамидальной формы, а во-вторых, проксимальную часть апикальных и/или базальных дендритов. Сохраните положение кепки, нажав на знак плюс в функции позиции. Таким образом, если колпачок переместить, он всегда вернется в то же самое место, для которого вы настроили размер пятна.

Введите эти значения в блок управления 70 в питание и 16 в длительность. Поскольку эти параметры специфичны для нашей ткани, мы рекомендуем вам протестировать и адаптироваться к этим переменным в соответствии с вашим конкретным образцом ткани, прежде чем начать. При лазерном захвате отдельных ячеек снимите флажок с параметра автоматического перемещения рабочей области и убедитесь, что символ нужного размера соответствует символу на панели справа.

Выберите опцию круга в правом нижнем углу, чтобы выбрать нейрон, захват которого вы хотите проверить. А после совмещения синего креста с кругом активируйте лазер, кликнув по тестовому ИК-пятну. Пятно, созданное лазером, должно сначала иметь четкое темное кольцо вокруг захваченного объекта.

Убедитесь, что кольцо достаточно большое, чтобы охватить клетку, но достаточно маленькое, чтобы оно не содержало нежелательных тканей или других клеток. Если это кольцо слишком светлое, то клетка не была захвачена. Если в середине темного кольца есть темное пятно, то длительность удара лазером слишком велика.

Повторите этот процесс на разных участках ткани в слое, который вы хотите захватить. Чтобы убедиться, что размер пятна не отличается в зависимости от местоположения, отрегулируйте его соответствующим образом. Идентификация пирамидальных нейронов для захвата примерно 500 клеток.

Нажмите кнопку лазерного захвата, чтобы захватить ячейки. Переместите колпачок на станцию контроля качества. Убедитесь, что было удалено не менее 90% нейронов.

Если нет, захватите больше клеток в области, где было захвачено большинство клеток. Поместите колпачок в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитра, содержащую 50 микролитров экстракционного буфера. Крышка была спроектирована таким образом, чтобы она идеально прилегала и предотвращала протекание буфера.

Переверните узел вверх дном, убедившись, что буфер для экстракции покрывает всю крышку, и поместите его на дно 50-миллилитровой пробирки Falcon на водяную баню, установленную при температуре 42 градуса Цельсия. Инкубируйте нейроны в течение 30 минут, чтобы удалить ткань из колпачка, после инкубации центрифугируйте пробирку и колпачок в сборе в течение двух минут при 800 г. После центрифугирования снимите крышку.

Если выделение РНК будет выполнено только в более позднее время. Храните оставшийся клеточный экстракт при температуре минус 80 градусов Цельсия. В противном случае продолжайте выделение РНК из клеточного экстракта, как показано в следующем разделе, выделение РНК выполняется с помощью набора для выделения PICO pure isolation, который предназначен для выделения небольшого количества клеток из образцов LCM и сохранения мРНК с низким содержанием.

Чтобы начать эту процедуру, добавьте 70% этанола, входящего в комплект, в экстракт клеток и центрифугируйте на предварительно подготовленной очистительной колонне. Чтобы связать РНК с колоночным фильтром после промывки, обработайте РНК D N, чтобы исключить риск интерференции ДНК. Этот шаг особенно важен в последующих приложениях, таких как R-T-P-C-R в режиме реального времени.

После расщепления ДНК добавьте 40 микролитров промывочного буфера и центрифугируйте очистительную колонку в течение 15 секунд при давлении 8 000 г. После этого приступайте к промывке в соответствии с протоколом, прилагаемым к набору, но продлите заключительную стадию промывки с помощью промывочного буфера два с двух до двух с половиной минут, чтобы убедиться, что в колонке не осталось буфера для промывки. что может снизить выход РНК. Перенесите колонку в другую микроцентрифужную пробирку. Добавьте элюцианский буфер и инкубируйте на фильтре в колонке в течение одной минуты, центрифугируйте колонку для элюирования РНК.

Наконец, проверьте качество извлеченной РНК, запустив лабораторный чип Experian High Sense, который предоставляет виртуальный гель и пипетку для электроферограммы 1,3 микролитра образца в пробирку объемом 0,5 миллилитров. Для проверки качества заморозьте оставшуюся часть образца при температуре минус 80 градусов Цельсия. После того, как качество РНК проверено, ее можно амплифицировать, мечить и гибридизовать.

Для анализа профилирования экспрессии генов будут проведены два раунда линейной амплификации с помощью набора ribo amp HS plus, в результате чего должно быть получено примерно 50 микрограммов амплифицированной РНК, достаточных для проведения экспериментов как с микрочипами, так и с Q-R-T-P-C-R. Для мечения амплифицированной РНК используется набор для мечения турбобиотина и мечение от молекулярных устройств. Наконец, будет выполнено профилирование экспрессии генов с использованием человеческого чипа X three P pro beret от atrix.

Результатом разреза ткани должно быть два предметных стекла по два среза на предметном стекле, всего четыре среза на каждый случай. Каждая секция должна быть гладкой с минимальными разрывами, растрескиванием или складываниями. Пирамидальные нейроны должны быть окрашены в темный цвет размером от 20 до 25 микрометров с пирамидальной формой и видимыми апикальными дендритами.

Во время ЛКМ, после того как лазер прошел через термопластичную пленку, клетки прилипают к колпачку и, следовательно, больше не находятся на предметном стекле, покидая окружающие ткани. Сзади примерно от 85 до 100% нейронов должны прилипать к колпачку с захватом ГС колпачка при макронастройках и правильной регулировкой мощности и мощности лазера. Для каждого участка вы должны получить от 500 до 700 клеток на участок, что дает не менее 500 пикограмм общей РНК на случай.

После полного выделения РНК качество РНК оценивается с помощью электроферограммы и виртуального геля с помощью BioRad Experian. На электроферограмме вы должны увидеть два отчетливых пика, соответствующих 18 с и 20 а с рибосомным РНК с посмертной тканью. Однако это не всегда так, так как ткань может деградировать из-за факторов, предшествующих разделению.

Обычно вы увидите большой бугорок, указывающий на деградацию, с большим пиком около 18 с и меньшим пиком 28 с, как указано красными стрелками. Напротив, на РНК плохого качества со слишком большой деградацией будет указывать электроферограмма с большой площадью под ее кривой. В дополнение к уменьшению местоположения спреда для проверки качества мРНК после двух раундов линейной амплификации, мы используем как стандартный лабораторный чип BioRad Experian, так и спектрофотометр NanoDrop.

Традиционная технология микрочипов Atrics требует, чтобы распространение транскрипта мРНК было не менее 600 нуклеотидов в длину, чтобы его можно было обнаружить с помощью этого протокола. Разброс мРНК достигал диапазона 1000 нуклеотидов, как показывает электроферограмма, с большими пиками, медленно снижающимися в зависимости от времени. Этот результат также подтверждается виртуальным гелем.

Если длина транскрипта меньше 600 нуклеотидов, образец не следует включать Для гибридизации показания NanoDrop показали среднее соотношение два 60 на два 80 или чистоту 2,5 между образцами. Средняя концентрация составила 1,7 микрограмма на микролитр, в результате чего было получено около 50 микрограммов мРНК на образец, что достаточно как для анализа микрочипов, так и для последующей валидации, для которой требуется от 15 до 20 микрограммов мРНК и последующей проверки результатов с помощью QR TPCR. Наши результаты показывают, что при использовании этого протокола как количество, так и качество полученной РНК достаточно хороши для исследования различий в экспрессии генов с помощью чипа atrix human X three P.

После гибридизации с чипом Atrics Human X 3 P мы достигли процента вызовов в среднем 26,6%, что указывает на адекватную гибридизацию и интенсивность зондов. Мы только что показали вам, как лазерно захватывать параметаллические нейроны из посмертной ткани мозга человека, чтобы использовать РНК, полученную из этих клеток. Для исследований профилирования G на микрочипах при выполнении этой процедуры важно выполнять все этапы в среде, свободной от РНК, и своевременно выполнять эти шаги, чтобы сохранить целостность РНК.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.