Глобальный анализ экспрессии генов Использование данио рерио Платформа Microarray олигонуклеотидов

Данная процедура начинается с кДНК, синтезированной на основе высококачественного матричного РНК. Сначала кДНК маркируют флуоресцентным красителем Cy3. По завершении реакции маркировки маркированную кДНК очищают, изолируют и оценивают качество проведенной реакции.

Затем меченая кДНК гибридизируется на микрочипе. После гибридизации массивы анализируют для определения относительных уровней экспрессии генов в образцах. Здравствуйте, меня зовут Сэм Питерсон, я представляю лабораторию доктора Дженнифер Фримен факультета медицинских наук Университета Пердью.

Ранее мы показали вам, как экстрагировать РНК из эмбрионов zebrafish и синтезировать на ее основе кДНК. Сегодня мы продемонстрируем процедуру мечения этой кДНК и ее гибридизации на олигонуклеотидную микрочиповую платформу zebrafish для изучения глобальных профилей экспрессии генов. Обычно мы используем данную процедуру для изучения дифференциальной экспрессии генов в ответ на воздействие токсина.

Итак, приступим. Эксперимент с микрочипами требует условий минимального освещения для предотвращения фотодеградации флуоресцентного красителя Cy3, используемого при маркировке. Для начала маркировки cDNA с помощью Cy3 разморозьте следующие компоненты системы геномного маркирования BioPrime Array CGH: 2,5-кратный буфер для случайных праймеров, 10-кратную смесь dCTP и воду, свободную от нуклеаз. Кроме того, разморозьте стоковый раствор маркированного Cy3 dCTP с концентрацией 1 mM. После размораживания коротко центрифугируйте реагенты и смешайте их в толстостенной пробирке объемом 0,6 мл.

500 nanograms кДНК в 40 microliters, 2.5 x буфер для случайных праймеров и воду, свободную от нуклеаз, для достижения общего объема 86 microliters. Тщательно перемешайте и кратко центрифугируйте, затем инкубируйте смесь в термоциклере при 100 °C в течение пяти минут. По окончании инкубации немедленно перенесите реакционную смесь в ледяную баню на 10 минут.

Затем извлеките экзонуклеазную ДНК-полимеразу из морозильной камеры и поместите её на лёд. Затем добавьте в пробирку с реакционной смесью 10 µL 10-кратной смеси dCTP, 2 µL 1 mM SI 3D CTP и 2 µL очищенной ДНК-полимеразы XO; тщательно перемешайте и кратковременно центрифугируйте. В завершение инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 16 часов в термоциклере до завершения процесса мечения.

Перейдите к очистке и осаждению меченой кДНК. Для начала очистки меченой кДНК поместите колонку MicroCon в пробирку объемом 1,5 мл.

Добавьте 300 µL 0.1 XSSC в колонку, а затем добавьте смесь для реакции мечения. Центрифугируйте колонку при 16 100 G в течение 10 минут при 4 °C. Обратите внимание, что фильтрат может иметь светло-розовый цвет.

Слейте фильтрат и добавьте в колонку еще 300 µL 0.1 X SSC. Затем повторите центрифугирование при 16 100 G в течение 10 минут при температуре 4 °C. Снова слейте фильтрат и добавьте в колонку еще 300 µL 0.1 X SSC, после чего проведите последнюю промывку путем центрифугирования при 16 100 G в течение 12 минут при температуре 4 °C.

Проточная фракция должна быть прозрачной, а меченая розовая кДНК должна быть видна на колонке. Снова удалите проточную фракцию после этого последнего промывания, чтобы элюировать меченую кДНК. Добавьте в колонку 100 µL воды, свободной от нуклеаз. Извлеките колонку из микроцентрифужной пробирки и переверните ее в новую пробирку.

Затем центрифугируйте перевернутую колонку при 2,300 G в течение двух минут при температуре четыре градуса Цельсия. Маркированная кДНК растворяется в воде на дне пробирки. Проверьте полученную кДНК с помощью спектрофотометра NanoDrop ND 1000 в соответствии с инструкциями производителя.

Рассчитайте концентрацию ДНК и оцените степень включения красителя согласно прилагаемому письменному протоколу. Если кДНК промаркирована достаточно, перенесите 6 µg в новую пробирку, чтобы осадить смесь маркированной кДНК, добавив 0,1 объема 3 M ацетата натрия (pH 5.2) и 1 объем изопропанола, после чего инкубируйте в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут.

Учитывая, что все предыдущие этапы проводились в условиях минимального освещения, центрифугируйте образец при 16 100 G в течение 20 минут при комнатной температуре. После центрифугирования осторожно слейте супернатант, не затрагивая розовый осадок ДНК.

В завершение провели промывку, добавив 500 µL 70% ethanol, после чего смесь перемешали путем осторожного переворачивания и центрифугировали при 16 100 G в течение пяти минут. При комнатной температуре удалили супернатант, перевернули пробирку и оставили осадок высыхать на пять минут. Маркированная CDNA готова к гибридизации.

Перед началом гибридизации включите систему гибридизации NimbleGen и дайте ей стабилизироваться при температуре 42 °C. Начните с растворения лиофилизированного осадка меченого CDN в 5 µL воды, свободной от нуклеаз. Добавьте компоненты для гибридизации из набора Roche NimbleGen Hybridization kit (буфер для гибридизации Hybrid A и выравнивающий олигонуклеотид) до общего объема 18 µL, как описано в прилагаемом письменном протоколе.

Тщательно перемешайте и кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы собрать содержимое на дне. Затем денатурируйте меченую кДНК, выдержав пробирку при 95 °C в течение пяти минут. Немедленно перенесите пробирку в систему гибридизации NimbleGen до момента готовности микрочипов.

Обратите внимание, что микрочипы требуют осторожного обращения и хранения. Массивы Roche nimble gen хранят в темноте с десикантом при комнатной температуре. Поместите массив в инструмент для выравнивания прецизионного миксера.

Установите смеситель X в PMA T и пинцетом удалите клейкую ленту. После установки массива и смесителя плотно закройте PMA T. Затем отсоедините массив и смеситель от PMA T, надавив на смеситель через отверстие в PMA T.

Наконец, с помощью валика приложите давление по внешнему контуру смесителя, чтобы убедиться в герметичности матрицы и удалить все пузырьки воздуха. Затем поместите комплекс «матрица-смеситель» в систему гибридизации для нагрева и нанесения образца кДНК на матрицу. Используйте вытеснитель медленно и с равномерным нажатием.

Добавьте 15 µL меченого образца в загрузочное отверстие в центре смесителя. Удалите излишки образца с отверстий и загерметизируйте их адгезивными полосками. Затем закройте защелку.

Теперь запустите перемешивание гибридизационного раствора, используя программу B на системе гибридизации nimble gen. Оставьте микрочип для гибридизации на 16–20 часов. После завершения гибридизации микрочип будет промыт и просканирован. Когда гибридизация будет близиться к завершению, подготовьтесь к сканированию, включив сканер массивов GenePicks 4,000 B и дав ему прогреться в течение примерно 15 минут.

Затем приготовьте промывочные буферы 1A, 1B, 2 и 3 согласно прилагаемому письменному протоколу. Предварительно нагрейте промывочный буфер 1A до 42 °C, остальные буферы оставьте при комнатной температуре. После того как промывочный буфер 1A нагреется, перелейте его в кювету.

Погрузите кассету для предметных стекол в промывочный буфер один B. Теперь извлеките комплекс смесителя микрочипа из системы гибридизации NimbleGen и установите его в зажим. Начните промывку, погрузив сборку в предварительно нагретый промывочный буфер один A, и осторожно снимите смеситель, отслаивая его от предметного стекла. Затем извлеките микрочип из зажима и перемешивайте в течение 15 секунд в промывочном буфере один A. Быстро перенесите микрочип в кассету для предметных стекол, погруженную в промывочный буфер один B, и интенсивно встряхивайте кассету в течение двух минут.

Затем перенесите кассету со стеклами в промывочный буфер 2 и перемешивайте в течение одной минуты. В завершение перенесите кассету со стеклами в промывочный буфер 3 и перемешивайте в течение 15 секунд. Завершите этапы промывки, поместив массив в центрифугу для сушки стекол и центрифугируя в течение двух минут.

Немедленно просканируйте массив, так как D чувствителен к свету и озону; начните сканирование, поместив массив штрих-кодом вниз в сканер массивов GenePicks 4,000 B. В диалоговом окне настроек оборудования установите для лазера с длиной волны 532 нанометров значение ФЭУ 500, мощность 100%, размер пикселя 5 мкм, усреднение по одной линии и позицию фокусировки 0 мкм. После завершения настройки выполните предварительный просмотр массива.

Выберите область для сканирования, а затем выполните сканирование. После завершения сканирования проверьте гистограмму изображения. В идеале значение 1E-5 нормированных отсчетов должно находиться на пределе насыщения 65 000, что означает насыщение примерно 1–2% объектов.

Если нормализованные значения подсчета составляют менее 1E-5, увеличьте усиление ФЭУ и повторно просканируйте предметное стекло. Если нормализованные значения подсчета превышают 1E-5, уменьшите усиление ФЭУ, повторно просканируйте предметное стекло, сохраните изображение и используйте программу для анализа данных для нормализации данных и расчета значений интенсивности. Реакция мечения обычно позволяет получить не менее 10 µg меченой кДНК.

Степень включения красителя можно рассчитать с помощью простого соотношения базовых красителей, где отношение нуклеотида к SI three равно отношению A two 60 к a five 50, умноженному на 23.15. При правильном протекании реакции значение будет находиться в диапазоне от 50 до 80. Приемлемая гибридизация характеризуется насыщением от 1 до 2% признаков.

Нормализованные значения 1E-5 при пределе насыщения 65 000. При установленном значении ФЭУ около 500 качество гибридизации также можно оценить качественно, просмотрев отсканированное изображение микрочипа и сравнив интенсивность выровненных олигонуклеотидов с другими элементами массива. На отсканированном изображении также следует проверить наличие специфических пятен или пыли в области массива.

В ходе последующего анализа для визуализации полученных данных можно использовать диаграмму рассеяния, чтобы определить относительные уровни экспрессии генов в образцах и выявить дифференциально экспрессируемые гены. Гены с дифференциальной экспрессией будут значительно отклоняться от линии наилучшего соответствия. В рамках дополнительной процедуры мы продемонстрировали способ выделения РНК из эмбрионов zebrafish и синтеза кДНК. В данном видео мы показали, как проводить мечение и гибридизацию кДНК на олигонуклеотидной микрочиповой платформе для изучения общих профилей экспрессии генов.

При выполнении данной процедуры всегда помните о необходимости использования высококачественного CD NA и избегайте воздействия прямого освещения на сайт three dye. На этом всё. Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.