Глобальный анализ экспрессии генов Использование данио рерио Платформа Microarray олигонуклеотидов

Эта процедура начинается с CDNA, которая была синтезирована из матрицы высококачественной РНК. CDNA сначала маркируется флуоресцентным красителем SI 3. По завершении реакции мечения меченую КДНК очищают, выделяют и оценивают качество реакции мечения.

Затем меченая КДНК гибридизуется на микрочипе. После гибридизации матрицы анализируются для определения относительных уровней экспрессии генов в образцах. Здравствуйте, меня зовут Сэм Петерсон из лаборатории доктора Дженнифер Фримен в Школе медицинских наук Университета Пердью.

Ранее мы показали вам, как извлечь РНК из эмбрионов рыбок данио и превратить эту РНК в CDNA. Сегодня мы покажем вам процедуру мечения и гибридизации этой CDNA на платформе микрочипов олигонуклеотидов данио-рерио для изучения глобальных профилей экспрессии генов. Как правило, мы используем эту процедуру для изучения дифференциальной экспрессии генов в ответ на воздействие токсина.

Итак, приступим. Эксперимент с микрочипами требует минимального освещения для предотвращения фотодеградации флуоресцентного красителя SI 3, используемого при мечении, чтобы начать мечение CD NA с помощью sci 3, а также следующих компонентов системы геномного мечения bio prime array CGH: 2,5 x случайный праймерный буфер, 10 смесь X-D-C-T-P и вода, свободная от нуклеазы. Кроме того, разморозьте один миллимолярный запас СИ с тремя мечеными DCTP после размораживания, кратковременно центрифугируйте или реагенты в нулевой пробирке толщиной 0,6 миллилитров вместе взятых.

500 нанограммов КДНК 40 микролитров, 2,5 случайных праймерных буфера и воды, не содержащей нуклеаз, для достижения общего объема 86 микролитров. Хорошо перемешайте и кратковременно центрифугируйте, затем инкубируйте реакцию при ста градусах Цельсия в термоамплификаторе в течение пяти минут. По окончании инкубации немедленно перенесите реакцию в кашицу ледяной бани на 10 минут.

Затем достаньте экзо-ДНК-полимеразу из морозилки и положите на лед. Затем добавьте в реакционную пробирку 10 микролитров 10 X-D-C-T-P. Смешайте два микролитра одного миллимоляра SI 3D CTP и два микролитра ДНК-полимеразы XO, хорошо перемешайте и кратковременно центрифугируете. Наконец, инкубируйте реакцию при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов и термоамплификаторе, когда маркировка будет завершена.

Приступайте к очистке и осаждению маркированной CDNA. Начать очистку маркированного CDNA. Поместите колонку MicroCon в пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Добавьте в колонку 300 микролитров и не 0,1 XSSC, а затем добавьте реакцию маркировки. Центрифугируйте колонку при 16, 100 G в течение 10 минут при четырех градусах SIU. Обратите внимание, что протекание может быть светло-розовым.

Отбросьте проточную часть и добавьте в колонку еще 300 микролитров нуля 0,1 XSSE. Затем повторите центрифугирование при 16, 100 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Опять же, отбрасывайте поток и добавляйте еще 300 микролитров T 0,1 XSSC в колонку, теперь центрифугируйте при 16, 100 G в течение 12 минут при четырех градусах Цельсия после этой последней промывки.

Сквозной поток должен быть чистым, а на столбце видна розовая маркировка CDNA. Опять же, отбросьте поток из этой последней промывки, чтобы ускользнуть от маркировки CD NA. Добавьте в колонку 100 микролитров воды, свободной от нуклеазы. Выньте колонку из микроцентрифужной пробирки и переверните ее в новую пробирку.

Затем центрифугируйте перевернутую колонку при температуре 2 300 G в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Меченая CDNA растворяется в воде на дне пробирки. Проверьте указанную КДНК с помощью спектрофотометра NanoDrop ND 1000 в соответствии с инструкциями производителя.

Рассчитайте концентрацию ДНК и оцените включение красителя, как описано в сопроводительном письменном протоколе. Если CDNA достаточно мечена, поместите шесть микрограммов в новую пробирку, чтобы осаждать меченую смесь CD NA в объеме 0,1 x трех моляров ацетата натрия при pH 5,2 и одном x объеме. Изопропанол выдерживают в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре.

Помня о том, что все шаги до этого момента были выполнены в условиях минимальной освещенности. Затем центрифугируйте образец при 16, 100 G в течение 20 минут при комнатной температуре. После центрифугирования осторожно выбросьте натант SUP, не потревожив гранулу ДНК, которая имеет розовый цвет.

Наконец, промывают, добавляя 500 микролитров, 70% этанола и перемешивают с помощью щадящей инверсионной центрифуги при 16, 100 г в течение пяти минут. При комнатной температуре извлеките супинат, переверните трубку и дайте грануле высохнуть в течение пяти минут. Меченая КДНК готова к гибридизации.

Перед началом гибридизации включите систему гибридизации Weimble Gen и дайте ей уравновеситься до 42 градусов по Цельсию. Начните с растворения меченой гранулы CD NA в пяти микролитрах воды, не содержащей нуклеаз, до растворенной гранулы. Добавьте компоненты гибридизации из набора гибридизации Roche Nimble Gen, буфер гибрида А и выравнивание олиго до общего объема 18 микролитров, как указано в прилагаемом письменном протоколе.

Хорошо перемешайте и коротко закрутите трубку, чтобы собрать содержимое на дне. Далее денатурируют, мечут CDNA, поместив пробирку при температуре 95 градусов Цельсия на пять минут. Немедленно перенесите трубку в систему гибридизации с проворным поколением, пока матрицы не будут готовы.

Обратите внимание, что микрочипы требуют бережного обращения и хранения. Матрицы Roche canmble gen хранятся в темноте с влагопоглотителем при комнатной температуре. Загрузите массив в инструмент для юстировки прецизионного миксера.

PMA T Загрузите миксер X one на PMA T и удалите клейкую полоску с помощью щипцов. Когда массив и смеситель загружены, надежно закройте PMA T. Затем отсоедините массив и смеситель от PMA T, подавив давление на смеситель через отверстие в PMA T.

Наконец, с помощью брайера надавите на внешнюю сторону смесителя, чтобы убедиться, что массив герметичный, и удалить любые пузырьки. Затем поместите комплекс смесителя матриц в систему гибридизации для нагрева, чтобы загрузить образец CDNA в матрицу. Используйте вытесняющий перпет медленно и с постоянным давлением.

Добавьте 15 микролитров маркированного образца в заливное отверстие в центре миксера. Сотрите лишнюю пробу с отверстий и заклейте их клейкими полосками. Затем закройте защелку.

Теперь начните смешивать решение для гибридизации с помощью программы B на системе гибридизации с гибким поколением. Дайте микрочипу гибридизоваться в течение 16–20 часов После гибридизации микрочип будет промыт и отсканирован, когда гибридизация будет близка к завершению. Подготовьтесь к сканированию, включив сканер матрицы Gene Picks 4000 B и дайте ему прогреться в течение примерно 15 минут.

Затем приготовьте промывочные буферы один А, один В, два и три, как указано в прилагаемом письменном протоколе. До войны при стирке буфер составлял от одного А до 42 градусов по Цельсию, а остальные буферы оставляли при комнатной температуре. Когда буфер для стирки один А прогреется, вылейте его в посуду.

Погрузите решетку слайдов в буфер промывки на один B. Теперь извлеките массивный смесительный комплекс из системы гибридизации проворного поколения и вставьте в приспособление. Начните промывку, погрузив сборку в буфер для предварительной промывки один А и осторожно снимите смеситель, отсоединив его от предметного стекла. Затем извлеките массив из кондуктора и перемешивайте в течение 15 секунд в буфере промывки один А. Быстро переложите массив в решетку, погруженную в буфер промывки 1 В, и энергично перемешивайте решетку в течение двух минут.

Затем переложите решетку для задвижек в буфер для стирки два и перемешивайте в течение одной минуты. Наконец, переведите решетку для слайдов в буфер промывки три и перемешивайте в течение 15 секунд. Завершите изготовление шайб, переместив массив в центрифугу для скользящей сушки и вращая в течение двух минут после центрифугирования.

Немедленно отсканируйте матрицу, так как D чувствителен к свету и озону, начните сканирование, загрузив штрих-код матрицы матрицы в сканер 4000 B матрицы. В диалоговом окне настройки аппаратного обеспечения 532-нанометровый лазер имеет значение ФЭУ, установленное на 500, установите мощность на 100% размер пикселя на пять микрон, линии на среднее значение на единицу и положение фокусировки на ноль микрон. Когда настройка будет завершена, просмотрите массив.

Выберите область для сканирования, а затем отсканируйте ее. После завершения сканирования проверьте гистограмму изображения. В идеале один E минус пять нормализованных подсчетов должен быть на пределе насыщения 65 000, что означает, что примерно от одного до 2% признаков являются насыщенными.

Если нормализованные подсчеты меньше одного E минус пяти, увеличьте усиление ФЭУ и повторно отсканируйте предметное стекло. Если нормализованное число больше одного E минус пяти, уменьшите усиление ФЭУ и повторно отсканируйте предметное стекло, сохраните изображение и используйте программу анализа данных для нормализации данных и вычисления значений интенсивности. Реакция мечения обычно дает не менее 10 мкг меченой CDNA.

Включение красителя может быть рассчитано с помощью простого соотношения основных красителей, где отношение нуклеотидов к SI три равно соотношению А, два, 60 к пяти 50, умноженному на 23 целых 15 пунктов. Хорошая реакция приведет к значению от 50 до 80. Приемлемая гибридизация будет иметь от одного до 2% признаков насыщенной урожайности.

Один E минус пять нормализованных отсчетов на пределе насыщения 65 000. Установив значение ФЭУ, можно также качественно оценить качество гибридизации, близкое к 500, просмотрев отсканированное изображение микрочипа и оценив интенсивность выровненных олигон по отношению к другим элементам матрицы. Отсканированное изображение также должно быть оценено на наличие каких-либо конкретных или пылевых пятен в области массива.

При последующем анализе точечная диаграмма может быть использована для отображения данных анализа, определения относительных уровней экспрессии генов в образцах и выявления генов, которые экспрессируются дифференциально. Гены, которые экспрессируются дифференциально, будут значительно отклоняться от линии наилучшего соответствия при дополнительной процедуре. Мы показали вам, как извлечь РНК из эмбрионов рыбок данио в синтез c CD NA. Здесь мы только что показали вам, как мечить и гибридизировать CD NA на олигонуклеотидной микролучевой платформе для изучения глобальных профилей экспрессии генов.

При выполнении этой процедуры всегда помните об использовании высококачественного CD NA и избегайте прямого воздействия на участок трех красителей. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.