Метод измерения Вирусный Кинетика Fusion на одном уровне частиц

Покровные стекла, используемые в этом анализе, функционализируются с помощью декстрина, а затем встраиваются в микрофлюидные проточные ячейки. Затем каждая проточная ячейка инкубируется с суспензией липосом, которые сливаются, образуя липидный бислой поверх гидратированного декстрина. Под флуоресцентным микроскопом добавляют меченый флюором вирус и меченный флуоресцеином стрептавидин, и вирусу дают пристыковаться к бислою.

Приток кислотного буфера инициирует слияние вируса с бислоем, а цифровая камера фиксирует изменения флуоресценции на протяжении всего анализа. Здравствуйте, меня зовут Дэниел Флойд, и я работаю в лаборатории Анина Ваниана на факультете биологической химии и молекулярной фармакологии Гарвардского университета. Сегодня я покажу вам метод визуализации кинетики вирусного синтеза на уровне отдельных частиц.

Мы используем эту процедуру в лаборатории для изучения того, как вирус проникает в клетки-хозяева. Итак, приступим. Начните этот протокол с подготовки функционализированных покровных бланков с помощью декстрина.

Первым шагом является ультразвуковая обработка покровных стекол растворами 10% моющего средства, одного молярного гидроксида калия ацетона и 100% ультразвука этанола в течение 30 минут на раствор. А между сеансами промываем деионизированной водой. После последней обработки ультразвуком промойте чехлы в воде, после чего просушите их в инкубаторе при температуре 80 градусов Цельсия.

Далее поместите крышки стекла в кислородную плазменную стриппер на три минуты. На этом этапе поверхность предметных стекол окисляется, что делает стекло равномерно гидрофильным и реакционноспособным на следующих этапах силососа. Далее погрузите покровные стекла в свежий раствор 0,2%gly oxy propyl trimeth oxypro trim methoxy в изопропаноле и инкубируйте в течение пяти минут.

Затем промойте покровные стекла несколько раз изопропанолом. Поместите крышку с покрытием SLAN при температуре 80 градусов Цельсия на один час. Отверждение на этом этапе позволяет слану ковалентно сцепиться со стеклом.

После отверждения расположите крышечные листы на внутренней стороне пластиковой морозильной камеры. Покройте верхнюю поверхность каждого покровного стекла примерно одним миллилитром раствора декстрина. 30% веса на объем в воде.

Закройте морозильную камеру и оставьте крышки в тихом месте на 24-36 часов. На следующий день слейте излишки декстрина, обхватив крышки пластиковыми щипцами и положите их обратно в керамическую стойку. Промойте их водой несколько раз и дайте им впитаться в воду на 48 часов.

Контейнер можно аккуратно взболтать на настольном вращателе, высушить крышку в духовке, установленной на 80 градусов Цельсия, и хранить в вакуумной сушке, пока вы не будете готовы к следующему шагу. Покрытие покровных стекол смесью липосом до образования строгального бислоя. Следующим этапом является подготовка липосом к образованию липидного бислоя в капюшоне, объединение всех растворенных в хлороформе липидов в стеклянной пробирке.

Липосомная формула включает в себя диаганглиевую сторону, которая связывает вирусные частицы, и биотинилированный липид, который связывает стрептавидин конъюгированный индикатор pH флуоресцеин. Далее испаряют растворитель под струей газообразного аргона или азота. И удалите остатки растворителя, оставив пробирку в вакуумной сушке на два часа.

Повторно суспендируйте высохшую липидную пленку в 400 микролитрах буфера HNE. Затем переложите суспензию в пластиковую микроцентрифужную пробирку. Заморозьте суспензию в ванне с жидким азотом и разморозьте на теплой водяной бане.

Повторите этот цикл замораживания и размораживания четыре раза после циклов замораживания. Используйте липидный экструдер с мембранным фильтром 100 нанометров для экструзии липидов. 25 раз после экструзии суспензия должна казаться более прозрачной.

Храните липосомы при комнатной температуре и используйте в день приготовления. Теперь, когда липиды готовы к работе, подготовьте микрофлюидную проточную ячейку. Во-первых, возьмите кварцевое стекло размером 20 на 20 на три миллиметра и с помощью алмазного жернова просверлите два отверстия диаметром в один миллиметр на противоположных сторонах.

Вырежьте квадрат 20 миллиметров из листа двойной клеевой ленты и с помощью лезвия бритвы. Вырежьте из центра разрез 15 на два миллиметра. Отклейте одну сторону скотчевой подложки и приклейте ленту к предметному стеколу.

Приклейте другую сторону к функционализированному покровному накладке, теперь отрезаем до 20 сантиметров полиэтиленовые трубки и вставляем их в отверстия в кварцевом предметном стекле. Наконец, запечатайте проточную ячейку пятиминутным эпоксидным клеем. Распределите клей по бокам кварцевого предметного стекла, чтобы приклеить его к покровному листу.

Используйте еще две капли клея, чтобы загерметизировать соединение между трубкой и кварцевым предметным стеколом. Когда клей застынет, загрунтуйте проточную ячейку и трубку буфером HNE. Далее, чтобы создать поддерживаемый липидный бислой, возьмите экструдированную липосомальную суспензию и наберите около 80 микролитров в каналы за день до эксперимента по термоядерному синтезу.

Начните маркировать вирусные частицы, чтобы пометить вирусную внутреннюю часть красным цветом. Соедините 20 микролитров свежеприготовленного серного рубца или раствора SRB с 10 микролитрами вирусной суспензии и оставьте при комнатной температуре на 20 часов. На следующий день удалите излишки красителя, пропустив вирусную суспензию через обессоливающую колонну PD 10 и разбавив 800 микролитрами буфера HNE.

Столбец должен иметь очевидную цветную полосу, которая содержит помеченный вирус. Соберите эту фракцию на следующем эллюцианском этапе, пометьте вирусный конверт зеленым цветом, добавив 13 микролитров Octa-декаля, RUMINE один 10 или RH один 10 C 18 в меченую вирусную суспензию SRB. Размешайте суспензию, присоединив пробирку к лабораторному вращателю, и оставьте на три часа.

Далее удалите излишки RH one 10 C 18 с помощью обессоливающей колонны PD 10. Как и прежде, сейчас вирус готов к фьюжн-анализу. Проведите анализ кинетики плавления с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного масляным иммерсионным объективом с высокой числовой апертурой.

Аргоннский криптоновый лазер возбуждает флюорочетверы в вирусной мембране и внутри него. Затем дихроичное зеркало разделяет красное и зеленое флуоресцентное излучение и независимо фокусирует изображения на отдельных половинах ПЗС-матрицы или камеры устройства с зарядовой связью, умножающей электроны. Установите крышку на предметный столик микроскопа и прикрепите выпускную трубку к шприцевому насосу, настроенному на расход со скоростью 100 микролитров в минуту.

Очистите проточные каналы от избытка липосом, введя 300 микролитров HNE. Сфокусируйте микроскоп и отрегулируйте мощность лазера, чтобы осветить поверхность с помощью света мощностью 350 Вт на квадрат квадрата света 488 нанометров, чтобы возбудить красную флору, и 4 и 70 Вт на квадрат квадрата сантиметра света 568 нанометров, чтобы возбудить зеленую флору. Четыре. Теперь, когда микроскоп готов, насос меченого вируса разводят один к сотне в проточную ячейку.

По мере того, как вирус диффундирует на нижнюю поверхность проточного канала, частицы начинают состыковываться. Прилипая к DIA ганглиев сбоку, встроенные в крышку скользящие, планарные бислой. Когда плотность состыкованных частиц достигнет примерно нескольких сотен частиц в поле зрения, начинают течь в растворе два микрограмма на миллилитр.

Флуоресцеин, меченный стрептококком стрептавидином, чувствительный к pH, поскольку меченый стрептавидин связывается с молекулами липидов, связанными с биотином, в бислое. Снова появляется тусклый зеленый фон, промойте проточный канал 300 микролитрами HNE. Теперь, когда вирусы состыковались и поверхность бислоя покрыта флуоресцеином, пришло время начать анализ.

Выберите область изображения, сфокусируйте микроскоп и подготовьте ПЗС-камеру к получению покадрового изображения. Установите время экспозиции на 100 миллисекунд и собирайте кадры со скоростью 10 герц. Инициируйте слияние мембран вируса путем протекания в кислотном буфере цитрата натрия.

По мере того, как pH падает, флуоресценция флуоресценции тускнеет, точно определяя время подкисления. ПЗС-камера записывает данные на протяжении всего анализа, которые можно использовать для определения времени сращения полуядерного синтеза и плохого формирования, как это задокументировано ПЗС-камерой. После падения pH происходят всплески зеленой флуоресценции, когда вирусная и планерная мембраны сливаются, липиды смешиваются, и зеленый краситель в вирусной оболочке разбавляется в плоской мембране.

Напротив, после падения pH происходит затухание красной флуоресценции, поскольку вирусная и липидная мембраны образуют поры, позволяющие красному красителю из вирусной внутренней части выходить в водное пространство под плоским бислоем, и эти тенденции также могут быть визуализированы с помощью флуоресцентных снимков до и во время слияния. Также построим график траекторий интенсивности флуоресценции для каждой частицы, как показано в этом примере, термоядерный синтез Hemi определяется как точка, в которой наклон интенсивности зеленой флуоресценции находится в самом крутом поровом образовании, как точка, в которой происходит затухание красной флуоресценции. Объединенные данные нескольких экспериментов для создания гистограмм слияния полуобразования и времени задержки образования пор, как показано здесь, используя время падения pH, поскольку t равно нулю, для синхронизации данных из разных экспериментов.

Я только что показал вам способ измерения кинетики вирусного синтеза на уровне отдельных частиц. При этом делать эту процедуру. Убедитесь, что вы используете чистые защитные стекла, чтобы у вас был однородный и жидкий бислой.

Кроме того, постарайтесь свести к минимуму количество света, которое вы используете во время флуоресцентной визуализации, чтобы свести к минимуму повреждение фотографий. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.