В естественных изображений из глубоких слоях коры использованием микропирамид

Под прямым углом микропризм вставляется в коре головного мозга мыши позволяет производить глубокое изображение нескольких коркового слоя с точки зрения обычно можно найти в срез. Один-миллиметровых микропризм предлагаем широкое поле сектор обзора (~ 900 мкм) и пространственным разрешением достаточно для разрешения дендритных шипиков. Мы показываем слой V нейронов изображений и неокортекса сосудистой визуализации с использованием микропризм.

Методы флуоресцентной микроскопии имеют ограниченные возможности для визуализации структур глубоко внутри тканей, особенно в материалах с высоким рассеиванием света, таких как ткань мозга. Даже в случае двухфотонной микроскопии может быть очень сложно получить высококачественные изображения in vivo нейронных структур, которые находятся глубже 500 микрон от поверхности неокортекса. Здесь зеленой линией обозначена глубина в 500 мкм.

Как правило, четвертый, пятый и шестой слои неокортекса находятся на расстоянии более 500 микрон от поверхности. Мы покажем, как стеклянная микропризма диаметром в один миллиметр, вставленная в неокортекс, может передавать свет в поверхностные и глубокие корковые слои и из них. Используя эту технику на мыши, можно получить поле зрения в один миллиметр и визуализировать все шесть слоев коры головного мозга одновременно с точки зрения визуализации, которая обычно встречается только в разрезанной ткани мозга.

Микропризмы предлагают широкое поле зрения, способное визуализировать тела параметаллических клеток пятого слоя с их длинными апикальными дендритами и сложной сетью кровеносных сосудов в неокортексе, сохраняя при этом пространственное разрешение, способное разрешать дендритные шипы и поток эритроцитов через микрокапилляры. Меня зовут Томас Чиа, и я аспирант в лаборатории профессора Майкла Левина на факультете биомедицинской инженерии Йельского университета. Протокол, который мы обсудим в этом видео, будет посвящен тому, как использовать стеклянные микропризмы под прямым углом в один миллиметр для создания флуоресцентных изображений структур глубиной в один миллиметр в неокортексе мыши.

Микропризмы, которые мы используем, представляют собой одномиллиметровые прямоугольные призмы, изготовленные из стекла BK seven, приобретенного у корпорации Opto Sigma. Микропризмы по возможности обрабатываются с помощью щипцов. Гипотенуза микропризмы покрыта усиленным серебром, что обеспечивает отражательную способность более 97% от 400 до 2000 нанометров.

Это обеспечивает внутреннее отражение как лазерного возбуждающего света, так и разрешенной флуоресценции. Мы используем специально изготовленный двухфотонный микроскоп, способный визуализировать мелких животных. Животное, прикрепленное к стереотаксическому устройству, размещается на трехосевой моторизованной сцене.

Микроскоп подключается к ПК с ОС Windows, на котором выполняется сканирование. Программное обеспечение для сканирования изображений — это программное обеспечение для получения изображений, написанное в MATLAB Поло Гудо и др. Для получения изображений с помощью микропризм мы собираем изображения с разрешением 10 24 на 10 24 или пять 12 на пять 12 пикселей.

Кроме того, мы обычно сканируем со скоростью две миллисекунды на строку или четыре миллисекунды на строку. Важным аспектом этого протокола является тип объективов микроскопа, используемых в сочетании с микропризмами. В экспериментах используются два типа целей.

Объектив слева представляет собой воздушный объектив с низкой числовой апертурой для получения изображений с широким полем зрения, в данном случае объектив Olympus четыре x 0,28 NA Olympus. Объектив справа представляет собой воздушный объектив с высоким уровнем NA 40 x 0,60 и стеклянным корректирующим кольцом, способным свести к минимуму сферические аберрации, вызванные толщиной стекла от нуля до двух миллиметров. Для того, чтобы подготовить мышь к хирургическому вмешательству и введению микропризмы, первым делом необходимо правильно обезболить животное до уровня, подходящего для хирургических процедур.

Во-первых, фиксируется вес животного на основе установленной дозировки. Соответствующий объем коктейля кетамина и ксилазина набирается в шприц. Обезболивающие препараты вводятся с помощью инъекции IP с помощью иглы 28 калибра.

После того, как мышь находится в плоскости анестезии, подходящей для хирургических процедур, большая часть шерсти на голове животного сбривается с помощью тремора с помощью лезвия номер 40. Затем nare наносится на оставшиеся волоски на голове, чтобы помочь создать поверхность, свободную от волосков, которые могут мешать микропризме. Во время визуализации, через пять минут, NA очищается С помощью ватного тампона животное под наркозом должным образом помещается в стереотаксическое устройство для мыши.

Во время хирургических процедур и сеансов визуализации животное содержится на наполненной водой грелке, установленной при температуре 36 градусов по Цельсию. Когда голова животного правильно зафиксирована на месте, делается один чистый разрез по медиальной линии черепа. Чтобы отделить кожу, небольшое количество перекиси водорода 3% наносят на ватный тампон и наносят на череп, чтобы очистить мембраны между черепом и кожей.

Перекись водорода также помогает выявить BMA, что является важным ориентиром в понимании того, где проводить трепанацию черепа и вставлять микропризму. Перед началом трепанации черепа ушные планки и прикусочная планка должным образом регулируются таким образом, чтобы наклонить открытый череп так, чтобы он был практически вровень со столом. Это обеспечивает лучшую платформу для трепанации черепа.

Небольшой зубной заусенец подключается к инструменту Dremel для краниотомии. Мы устанавливаем скорость примерно от 7 000 до 10 000 оборотов в минуту. Зубной заусенец скользит вдоль черепа до тех пор, пока в кости не образуется квадратная бороздка.

Стороны квадрата имеют длину примерно два-три миллиметра и расположены по центру. 1,5 миллиметра латерального рема продолжают истончать кость до тех пор, пока в черепе не будет сделано небольшое отверстие. Пара щипцов может приподнять костный лоскут.

Твердая мозговая оболочка должна быть удалена, прежде чем микропризма может быть вставлена в кору головного мозга. Кровотечение лучше всего контролировать, позволяя крови сворачиваться на поверхности в течение нескольких минут. После этого свернувшаяся кровь удаляется с помощью хирургической губки, чтобы помочь выровнять призму с корой головного мозга.

Вертикальная поверхность микропризмы выровнена параллельно ручкам на щипцах. При правильном удержании призмы вся микропризма вставляется до тех пор, пока верхняя часть призмы не окажется на одном уровне с поверхностью неокортекса. Здесь мы можем видеть призму, покоящуюся в неокортексе.

При правильной установке микропризма должна оставаться в правильном положении. Любое кровотечение, которое возникает, минимально и может быть поглощено небольшой хирургической губкой. Как только призма будет на месте, животное будет готово к визуализации вместе с животным.

При малом увеличении объектива можно увидеть, как лазерный растр сканирует микропризму на поверхности мозга. Вот несколько типичных примеров изображений, полученных от трансгенных мышей, экспрессирующих желтый флуоресцентный белок. В пятом слое корковых нейронов, использующих микропризмы, можно увидеть скопление крупных параметаллических клеточных тел в пятом слое, почти на один миллиметр ниже поверхности коры.

Также видны апикальные дендриты, которые проходят через все поверхностные слои, прежде чем расходиться в пучки, с помощью объектива с высокой числовой апертурой и стеклянным корректирующим воротником, в этом случае можно разрешить дендритные шипы. На апикальных дендритах параметаллических нейронов пятого слоя дендритные шипы представляют собой субмикронные структуры, и некоторые из них обозначены на изображении с помощью желтых стрелок. Можно также пометить корковые кровеносные сосуды флуоресцентным красителем, таким как флуоресцеин декстран, используя установленные методы инъекции в хвостовую вену.

Используя эту технику, можно увидеть, как сосуды большего калибра выходят из глубоких слоев, простираясь к PIA и разветвляясь, образуя сеть микрокапилляров. Эту тонкую сеть микрокапилляров в неокортексе лучше всего оценить с помощью объектива с высокой числовой апертурой. Кроме того, можно измерить скорость и поток эритроцитов из глубоких неокортикальных капилляров с помощью линейного сканирования.

Красная линия указывает на картину сканирования линии на капиллярном изображении через микропризму. Поскольку красные кровяные тельца не поглощают флуоресцентный краситель, они будут проявляться в виде темных полос. Изображение внизу является результатом линейного сканирования с пространственным измерением в одном AE и временным измерением в другом.

НЯ из этого можно рассчитать поток и скорость прохождения эритроцитов через капилляр. После того, как микропризма была использована у животного, ее можно использовать повторно несколько раз. Тем не менее, его необходимо тщательно очистить, чтобы удалить любой оставшийся биологический материал.

Это может быть достигнуто путем погружения призмы в небольшой объем соляной кислоты с последующим погружением в метанол. Затем чистую микропризму можно завернуть в бумагу для линз до использования функции. На этом мы завершаем наш протокол по использованию микропризм для визуализации коры головного мозга in vivo у мышей.

Использование микропризм в эксперименте по визуализации относительно просто и дает много преимуществ, когда речь идет об исследованиях неокортекса in vivo. Мы надеемся, что вы нашли эту технику интересной и сможете использовать ее в своей лаборатории в будущем. Спасибо за просмотр и удачи.