Количественная оценка Дрожжи Lipidome использованием Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Этот протокол позволяет быстро проанализировать основные компоненты липидов дрожжей. Он начинается с сбора и промывания дрожжевых клеток. Промытые клетки помещают в одну-две смеси хлороформа, метанола и лизируют стеклянными шариками.

Добавление хлороформа и воды разделяет две фазы. Органическую фазу собирают, сушат, а затем растворяют липидную пленку в хлороформе для хранения перед масс-спектроскопией. Извлеченные липиды разбавляют в хлороформе и метаноле с гидроксидом аммония и добавляют смесь внутренних норм.

Теперь липидный раствор можно вводить непосредственно в масс-спектрометр. Здравствуйте, я Саймон Борк из лаборатории Владимира Теко на биологическом факультете Университета Конкордия. Сегодня я покажу вам метод количественного определения липидов дрожжей с помощью масс-спектроскопии.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения изменений липидов дрожжей при различных условиях роста. Итак, приступим. Чтобы начать эту процедуру, ресуспензию предварительно приготовленных замороженных дрожжевых гранул суспензируют в 1,6 миллилитрах льда, холодной дистиллированной воды, а 1,6 миллилитра клеточной суспензии переносят в высокоскоростные стеклянные центрифужные пробирки.

Отметим, что на протяжении всей этой процедуры все манипуляции с извлеченными липидами производятся с помощью стеклянных пипеток или шприцев. Поскольку пластмассы создают большой фоновый сигнал, если они вступают в контакт с хлороформом, начните экстракцию липидов, добавив в клеточную суспензию шесть миллилитров смеси метанола хлороформа в соотношении один к двум и 0,8 миллилитров стеклянных шариков, измеренных в эйноровой трубке. Точные объемы не критичны, если соотношения один к двум к 0,8 для хлороформа, метанола и дрожжей, взвешенных в воде. Вихрь.

Клеточную суспензию и стеклянные шарики смешивают два раза в течение одной минуты каждый раз, продолжают, добавляя два миллилитра хлороформа и осторожно перемешивая, затем инкубируют в течение пяти минут при комнатной температуре с редким перемешиванием. После пятиминутной инкубации добавьте два миллилитра дистиллированной воды и аккуратно перемешайте. Затем снова выдержать в течение пяти минут при комнатной температуре с периодическим перемешиванием.

Здесь также более важно поддерживать соотношение два к двум к 1,8 для хлороформа, метанола и воды, а не определенный объем. Когда вторая инкубация будет завершена. Центрифугируйте в течение пяти минут при 3000 G при комнатной температуре, соберите всю надосадочную жидкость из этой первой экстракции в новую высокоскоростную стеклянную центрифужную пробирку и добавьте 3,2 миллилитра хлороформа к оставшимся клеточным гранулам для второй экстракции липидов.

Сделайте вихревой перемешивание клеточных гранул с добавленным хлороформом два раза по одной минуте каждый раз. Затем центрифугируйте в течение пяти минут при 3000 Gs При комнатной температуре добавьте надосадочную жидкость из этой второй экстракции к надосадочной жидкости, собранной после первой экстракции. Далее центрифугируйте собранные надосадочные жидкости в течение пяти минут.

При 3000 G при комнатной температуре экстрагированные липиды теперь растворяются в более низкой органической фазе. Отбросьте верхнюю водную фазу и перенесите нижнюю фазу в новую высокоскоростную стеклянную центрифужную трубку. Для получения более чистых спектров на масс-спектрометре центрифуге органическую фазу в течение пяти минут при 3000 G при комнатной температуре и переложить всю надосадочную жидкость в стеклянный флакон.

Растворенные липиды высушить под азотом, растворить высушенную липидную пленку в 500 микролитрах хлороформа и хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия до готовности к анализу образцов методом масс-спектрометрии. Начните с приготовления стандартной смеси липидов в хлороформе, как указано в таблице 1 в прилагаемом письменном протоколе. Каждый липид представляет собой отдельный класс.

Этот раствор можно хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия для последующего использования перед введением извлеченных липидов в масс-спектрометр. Соединяют 10 микролитров образца с 10 микролитрами стандартной смеси липидов. Обратите внимание, что стандартное соотношение к выборке может быть изменено по мере необходимости.

Разрешите смесь образца и стандартных липидов с помощью микромасс-спектрометра от Q до F двух, оснащенного нано-электроспреем, работающим со скоростью потока один микролитр в минуту. Настройки подробно описаны в таблице 2 прилагаемого письменного протокола. Несмотря на то, что использование масс-спектрометра с высоким разрешением от Q до F является преимуществом, это не является обязательным требованием.

Точные параметры прибора будут варьироваться в зависимости от масс-спектрометра. После сбора данных масс-спектры сглаживаются, фон вычитается, а пики центрируются. Наконец, экспортируйте список пиков в Excel.

Затем нормализуйте пики каждого липидного стакана до их внутреннего стандарта. В зависимости от области применения может потребоваться дальнейшая постобработка, такая как деизотопная и деконволюционная. Этот метод позволяет быстро и глубоко определить основные компоненты липидов дрожжей.

Здесь мы выделили один липид, который был изотопом de convoluted и нормализован до своего внутреннего стандарта. Мы только что показали вам, как выделить липиды дрожжей и как определить липиды дрожжей с помощью масс-спектроскопии с электронным дисплеем. При выполнении этой процедуры важно помнить о том, что следует избегать использования пластика и держать образец в линейном диапазоне концентраций.

Этот метод достаточно гибкий и во многих объемах может быть изменен по мере необходимости. Этот протокол экстракции также подходит для других методов анализа липидов, таких как тонкослойная хроматография и многомерная масс-спектроскопия. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.