Удлинения праймера Capture: Целевые поиска последовательностей из сильно деградированных Источники ДНК

В данном видео объясняется метод захвата путем достройки праймеров (primer extension capture, PECA), который позволяет осуществлять целевое извлечение последовательностей ДНК из источников с крайне низким числом копий и высокой степенью фрагментации ДНК. Мы использовали этот метод для секвенирования полных митохондриальных геномов из костей неандертальцев возрастом более 40 000 лет; данный метод может быть применен для захвата любых малых целевых областей или однонуклеотидных полиморфизмов у многих особей. Основными этапами данной процедуры являются ПЦР-амплификация первичной библиотеки ДНК, количественное определение амплифицированной библиотеки с помощью количественной ПЦР, целевая первичная достройка на амплифицированной библиотеке, захват продуктов первичной достройки на магнитных частицах для удаления нецелевых фрагментов, а также элюция и секвенирование захваченных и промытых целевых последовательностей.

Здравствуйте, я Адриан Бриггс из лаборатории Шанти Пэйбл на кафедре генетики Макса Планка в Институте эволюционной антропологии в Лейпциге. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру выделения специфических интересующих нас последовательностей ДНК из сложного, сильно деградировавшего источника ДНК, такого как древние кости. Мы использовали эту процедуру для изучения митохондриального генетического разнообразия Homo neanderthalensis, или неандертальца.

Приступим к работе. ДНК, используемая в нашем эксперименте, выделена из костей неандертальцев возрастом от 40 000 до 70 000 лет, которые были найдены в различных точках географического ареала неандертальцев. Сначала кость подвергают воздействию УФ-излучения в течение ночи, чтобы очистить поверхность от любой посторонней ДНК.

С помощью тонкого сверла получают от 100 до 500 мг костного порошка. ДНК экстрагируют из костного порошка по методике, описанной в статье 2007 года «Сравнение и оптимизация экстракции древней ДНК», авторами которой являются Nadine Rockland и Michael Hof. Затем экстракт ДНК преобразуют в библиотеку для секвенирования путем добавления универсальных праймерных сайтов адаптеров на концы всех фрагментов ДНК, поскольку библиотека 454, созданная из кости неандертальца, содержит лишь ничтожно малое количество ДНК, иногда всего несколько пг. Эта первичная библиотека ДНК сначала амплифицируется с помощью ПЦР с использованием праймеров для эмульсионной ПЦР, соответствующих универсальным праймерам библиотеки.

Для приготовления смеси для ПЦР с целью амплификации библиотеки объедините в ПЦР-пробирке следующие реагенты: 10 µL 10X GAMP ПЦР-буфера, 2 µL хлорида магния, 2 µL BSA, 1 µL смеси dNTP, по 3 µL прямых и обратных праймеров 4 54 MPCR, 1 µL ДНК-полимеразы AmplyGold и 25 µL матрицы библиотеки. В завершение добавьте 45 µL воды ПЦР-качества, чтобы получить общий объем 100 µL. ДНК-полимераза AmplyTech Gold стабильна при комнатной температуре, поэтому работать на льду не обязательно.

После подготовки ПЦР-реакции поместите ПЦР-пробирку в амплификатор. Начните с этапа денатурации при 95 °C в течение 12 минут, затем проведите 14 циклов: 95 °C в течение 30 секунд, 60 °C в течение одной минуты и 72 °C в течение одной минуты. По завершении этих 14 циклов установите финальный этап при 72 °C в течение пяти минут, после чего ПЦР-пробирку можно бессрочно хранить при 10 °C до начала дальнейшего использования. После завершения ПЦР-амплификации проведите очистку ПЦР-продукта с помощью спин-колонки Kyogen MinLu согласно инструкциям производителя; элюируйте ДНК из колонки 50 µL буфера EB, входящего в набор MinLu, перед первичным достраиванием и захватом продукта.

Количественную ПЦР следует провести на аликвотах неамплифицированной и амплифицированной библиотек, чтобы количественно определить и проверить качество продукта амплифицированной библиотеки. Амплифицированная библиотека после 14 циклов должна содержать в несколько тысяч раз больше ДНК, чем первичная библиотека. Если это не так, условия амплификации необходимо проверить и повторить.

Праймеры для первичного захвата экстензии, которые будут использоваться для захвата интересующих последовательностей из амплифицированной библиотеки, должны быть сконструированы как обычные ПЦР-праймеры для соответствия желаемому целевому региону с идеальной температурой плавления 60 °C на 5'-конце каждой из этих целевых последовательностей с 12-нуклеотидным хвостом и включать остаток биотина на 5'-конце. В одной мультиплексной смеси, приготовленной из стоковых растворов с концентрацией 200 µM, можно использовать до 150 PEC-праймеров. Для реакции первичной экстензии приготовьте ПЦР-смесь в подходящей ПЦР-пробирке, добавив 5 µL 10X GAMP ПЦР-буфера, 2,5 µL хлорида магния, 1 µL BSA и 0,5 µL dNTP. Смешайте 5 µL смеси праймеров для первичного захвата экстензии, 0,5 µL Taq Gold ДНК-полимеразы, 2 µL ДНК библиотеки после 14 циклов амплификации и, наконец, 31 µL воды ПЦР-качества, чтобы получить общий объем 50 µL.

Если концентрация амплифицированного шаблона библиотеки превышает 1 × 10¹² копий на микролитр, шаблон следует предварительно развести буфером EB таким образом, чтобы в реакционную смесь было добавлено не более 2 × 10¹² копий. После подготовки ПЦР-пробирки поместите ее в амплификатор и установите параметры для одного цикла реакции. Начните с денатурации при 95 °C в течение 12 минут, затем при 60 °C в течение одной минуты и пяти минут при 72 °C для первичной элонгации.

По завершении одного цикла поддерживайте температуру 72 °C для сохранения ПЦР-продукта до следующего этапа. Чтобы избежать неспецифичного отжига праймеров, непосредственно добавьте 150 µL буфера PBI или PB из набора для очистки Kyogen в пробирки с ПЦР-реакцией, пока реакционная смесь находится в термоциклере при температуре 72 °C. Это инактивирует полимеразу, при этом температура остается слишком высокой для неспецифичного достраивания целевых праймеров; закройте пробирки, коротко перемешайте их на вортексе, а затем осадите жидкость с помощью настольной центрифуги.

На данном этапе используйте только буфер PBI или PB, так как другие связывающие буферы, такие как буфер PM от Qiagen, могут помешать последующему процессу захвата. Затем извлеките смесь из ПЦР-пробирки и перенесите ее в спин-колонку Rogen MinLu для очистки в соответствии с инструкциями производителя, как было сделано ранее; элюируйте ДНК из колонки 30 microliters буфера EB, входящего в комплект MinLu. Чтобы удалить все фрагменты, которые не отжеглись к праймерам PEC, проводится этап захвата с использованием магнитных частиц.

Сначала ресуспендируйте стоковый раствор магнитных частиц M 270 путем вортексирования и отберите количество частиц, эквивалентное 25 µL на образец. Промойте частицы дважды 500 µL 2-кратного буфера BW и ресуспендируйте их в объеме 2-кратного буфера BW, равном объему изначально взятых частиц. Приготовьте 25 µL данной суспензии.

Для каждого образца добавьте 25 µL очищенной элюированной ДНК к 25 µL суспензии магнитных частиц, сохранив оставшиеся 5 µL для последующего количественного анализа. Перемешайте ДНК и суспензию частиц путем пипетирования и перемешивания кончиком наконечника, затем медленно вращайте на лабораторном ротаторе в течение 15 минут при комнатной температуре. После перемешивания перенесите содержимое в новую ПЦР-пробирку объемом 1,5 мл.

На предыдущем этапе инкубации с перемешиванием часть нецелевой ДНК могла прилипнуть к стенкам пробирки. Перенос суспензии гранул в новую пробирку позволяет избежать попадания этой нецелевой ДНК в конечные продукты. На этапе тепловой элюции используйте магнитный сепаратор для осаждения гранул; через 10–20 секунд все гранулы переместятся к стенке, оставив прозрачный супернатант, который следует удалить для промывки гранул. Добавьте в пробирку 500 µL 1× буфера BW и перемешайте на вортексе в течение примерно трех секунд на низкой скорости.

При проверке в вертикальном и перевернутом положениях пробирки на ее стенках не должно остаться прилипших гранул. С помощью настольной центрифуги центрифугируйте суспензию в течение одной-трех секунд — ровно столько, сколько потребуется, чтобы собрать всю жидкость со стенок пробирки. Поместите пробирку обратно в MPC и подождите 10–20 секунд, пока все гранулы не соберутся у стенки пробирки.

Затем удалите супернатант. Первая промывка завершена. Повторите эту процедуру еще четыре раза после последнего цикла промывки BW и удаления супернатанта.

Добавьте 500 µL 1x буфера для горячей промывки. Перемешайте суспензию, кратковременно обработав ее на вортексе и центрифугировав, как и прежде, затем инкубируйте пробирку в течение двух минут при 65 °C на термошейкере при 1000 RPM; после этого кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы удалить остатки супернатанта, в течение одной минуты после извлечения из термоблока. Этот этап позволяет удалить фрагменты, которые могли связаться с праймерами PEC, но не были достроены на этапе элонгации праймеров. Ресуспендируйте осадок в 30 µL буфера EB и перенесите смесь в новую ПЦР-пробирку объемом 1.5 мл.

Инкубируйте пробирку в термоциклере при 95 °C в течение трех минут. Осадите гранулы в коллекторе магнитных частиц. Для полного осветления супернатанта должно потребоваться от 10 до 20 секунд; после этого перенесите супернатант S в новую маркированную пробирку.

Следите за тем, чтобы не перенести частицы магнитных бусин. Сохраните супернатант, содержащий захваченные фрагменты ДНК. Бусины на данном этапе можно утилизировать.

Для амплификации захваченного продукта приготовьте ПЦР-смесь общим объемом 100 µL, как это было сделано во второй части, и используйте те же условия циклов ПЦР. После завершения ПЦР-амплификации захваченного продукта проведите очистку с использованием спин-колонки Qiagen Ute, как было описано в разделе два; элюируйте ДНК из колонки 50 µL буфера Eeb. Теперь продукт готов к высокопроизводительному секвенированию. Мы разработали 574 праймера PEC для покрытия всего митохондриального генома неандертальца.

Мы разделили их на четыре мультиплексные смеси и провели два последовательных раунда первичного захвата путем экспансии (PEC) библиотек, полученных из пяти окаменелостей неандертальцев из четырех стоянок по всей Евразии, датируемых периодом от 40 000 до 70 000 лет; в результате для каждой особи было получено от 170 000 до 500 000 последовательностей, которые затем были выровнены по референсной последовательности митохондриальной ДНК. Мы обнаружили, что процедура PEC привела к массивному обогащению митохондриальной ДНК, обеспечив полное покрытие митохондриального генома для каждой особи со средним кратным покрытием от 18 до 56,3. На основании этих результатов нам удалось восстановить высококачественную полную последовательность митохондриального генома для каждой особи.

Затем мы провели филогенетическое сравнение этих последовательностей с глобальной выборкой современных людей и наших ближайших ныне живущих родственников — шимпанзе и бонобо. Это подтвердило предыдущие данные о том, что митохондриальная ДНК неандертальцев тесно связана с ДНК современных людей, но при этом четко от нее отличается. Более того, сравнение самих последовательностей неандертальцев выявило крайне низкое генетическое разнообразие у неандертальцев — более низкое, чем у современных людей во всем мире, и схожее с показателями современных европейцев.

Эти данные в сочетании с анализом эволюции белков в последовательностях неандертальцев позволяют предположить, что неандертальцы на протяжении длительного времени имели низкую численность популяции, что согласуется с археологическими данными, указывающими на то, что плотность населения неандертальцев никогда не достигала уровней, характерных для современных людей. Мы только что продемонстрировали вам, как проводить захват с удлинением для приматов, чтобы амплифицировать и захватывать целевые последовательности в preparation к высокопроизводительному секвенированию. При выполнении данной процедуры важно строго соблюдать все температурные режимы в термоциклере, однако учитывайте, что праймеры могут иметь разную температуру отжига, поэтому вам может потребоваться скорректировать температуру отжига в соответствии с вашими конкретными праймерами, а также проявлять осторожность на всех этапах промывки, чтобы удалить как можно больше жидкости.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.