Мониторинг функции сердца в личинок Дрозофилы Для физиологических исследований

Drosophila генетически привлекательны для исследования развития и функционирования сердца, а также лежащей в его основе активности водителя ритма. В данной процедуре показано, как подготовить препараты как целых, так и препарированных личинок, а также как проводить мониторинг частоты сердечных сокращений. Препарированный образец также позволяет регистрировать внеклеточные или внутриклеточные потенциалы для дальнейшего изучения функций ионных каналов.

Здравствуйте, я Робин Купер, преподаватель кафедры биологии Университета Кентукки. Сегодня мои студенты, Энн Купер, Кайла Райман, Мэтт Уорд и Истер Боку, продемонстрируют вам различные процедуры мониторинга частоты сердечных сокращений у личинок Drosophila. Следующий метод без фиксации называется «муравьиная ферма», так как личинки визуализируются в одной фокальной плоскости.

Для оптимальной визуализации личинок используйте диссекционный микроскоп с объективом 2x и окулярной линзой 0,5x, что обеспечит наилучшее пространственное разрешение и увеличение на прямоугольном участке размером 1 см на 0,5 см. Фотографии и видео можно записывать с помощью камеры, установленной на окуляре. Чтобы приступить к выполнению метода, поместите личинку вместе с тонким слоем корма между двумя предметными стеклами.

Предметные стекла зафиксированы на расстоянии от 1 до 1,5 мм друг от друга с помощью пластиковых проставок по всем четырем сторонам. Наклоните препарат под углом от 20 до 45 градусов на несколько минут, чтобы личинка держала голову, направленную вниз. Отрегулируйте зеркало микроскопа для достижения наилучшего контраста сердца или двух трахей, чтобы наблюдать за сердцебиением.

Метод приклеивания представляет собой способ постоянного закрепления личинок на предметном стекле. Для начала этого метода поместите чистое покровное стекло поверх предметного стекла. Нанесите маленькую каплю суперклея на один из углов покровного стекла.

Затем промойте личинок водой. Чтобы удалить остатки корма, впитайте жидкость салфеткой или краем бумажного полотенца. После тщательного промывания личинки осторожно возьмите её чистым пинцетом и поместите на предметное стекло под микроскопом на расстоянии от покровного стекла, ориентируя личинку брюшной стороной вниз.

На брюшке будут видны слабые горизонтальные бороздки с тонкими черными волосками. Спинка личинок должна быть обращена вверх; на ней расположены две продольные полосы, которые представляют собой трахеи. Используя второй набор пинцетов, предназначенных исключительно для работы с клеем, возьмите небольшое количество клея из капли на конце предметного стекла и нанесите его на угол с противоположной стороны.

Используйте минимальное количество клея, достаточное лишь для того, чтобы покрыть кончик пинцета. Возьмите животное и поместите его на клей, убедившись, что оно зафиксировано брюшной стороной вниз на черном отверстии.

Крючки должны находиться на краю или около края покровного стекла; это касается ротовых крючков и коричней спирали. Они не должны касаться клея. Осторожно прижмите личинку, чтобы расправить ее.

Для нанесения исследуемого вещества рекомендуется с помощью шприца дозировать небольшие капли рядом с головой личинки. Частоту сердечных сокращений определяют путем подсчета количества пульсаций спиралей за одну минуту. При длительном наблюдении личинок можно кормить непосредственно на месте и увлажнять для предотвращения дегидратации. Чтобы изготовить предметное стекло для диссекции, пригодное для использования под микроскопом, с помощью скальпеля вырежьте отверстие диаметром 2 см в центре фрагмента магнитной ленты и приклейте его к стеклянному предметному стеклу.

Для облегчения фиксации используйте препаровальные булавки, согнутые и приклеенные к канцелярским скрепкам. В процессе препарирования поместите неповрежденную личинку стадии «третьей звезды» на препаровальную пластину. При расположении спинной стороной вверх трахея должна быть видна сквозь кутикулу.

Зафиксируйте личинок двумя булавками по обе стороны от ротовых крючьев и еще двумя булавками по обе стороны от спиралей. Затем добавьте физиологический раствор, чтобы поддерживать личинок во влажном состоянии. После этого сделайте горизонтальный разрез у конца коддла, за которым следует продольный разрез, который должен проходить вдоль спиралей в направлении головы животного.

Приподнимите одну из дорсальных булавок и зацепите её под кутикулу. Используйте булавку, чтобы раздвинуть ткани. Вскройте полость тела.

Повторите процедуру с остальными тремя булавками. После того как тело животного будет зафиксировано в расправленном состоянии, удалите внутренние органы, стараясь не повредить трахею или сердце. Некоторые структуры, включая мозг и некоторые жировые тела, прикреплены к сердцу, и их удаление может привести к его повреждению.

Оставьте препарат для восстановления в растворе HL three на три–пять минут после препарирования; внутриклеточные и полевые регистрации в данном препарате проводятся при прямом нанесении фармакологических агентов на сердце. Общее время этого этапа препарирования составляет от трех до шести минут. Для проведения электрической стимуляции сначала необходимо изготовить фокальные электроды: для этого стеклянный электрод проводят над нагревательным элементом для огневой полировки и делают постепенный изгиб примерно под углом 45 градусов, затем фокальный электрод, заполненный раствором HL three комнатной температуры, устанавливают в манипулятор концом вниз.

Убедитесь, что провод стимулятора касается физиологического раствора внутри электрода и что стимулятор выключен. Закрепите свежий препарат препарированного сердца на микроскопе. Поместите заземляющий провод в физиологический раствор.

Осторожно перемещайте электрод, следя за тем, чтобы не задеть контакты и не нарушить целостность препарата. Сохраняя фокус на электроде, с помощью манипулятора опустите его в физиологический раствор. Оказавшись в растворе, расположите кончик электрода так, чтобы просвет был плотно прижат к сердцу и слегка касался его.

После установки электрода установите частоту стимулятора на 2 Hz, выставив напряжение на минимальный уровень. Включите стимулятор. Отрегулируйте частоту примерно до 3 Hz и медленно увеличивайте напряжение до тех пор, пока частота сердечных сокращений не увеличится и не синхронизируется с ритмом стимулятора.

Теперь с помощью стимулятора можно манипулировать ритмом. Для проверки влияния на сокращение или электрическую проводимость можно добавлять различные соединения. Для регистрации полевых потенциалов заполните макропатч-электрод банным раствором и установите его в манипулятор на сложном микроскопе.

Подключите электрод к усилителю и системе регистрации данных. С помощью манипулятора опустите просвет электрода над сердцем диссекированного препарата, закрепленного на микроскопе. Очень осторожно коснитесь сердца кончиком электрода.

Теперь можно провести внеклеточную регистрацию для записи полевых потенциалов из другого отдела сердца. Осторожно поднимите кончик электрода и с помощью манипулятора переместите его в новую область, затем повторно выполните регистрацию полевых потенциалов. Это позволит точно контролировать частоту и продолжительность электрических сигналов в сердце для измерения трансмембранных потенциалов миоцитов личинок.

Сначала убедитесь, что просвет острого электрода, заполненного 3 M хлоридом калия, плотно прилегает к сердцу под углом примерно 45 градусов по отношению к вертикали. После правильного позиционирования осторожно коснитесь кончиком электрода сердца и аккуратным постукиванием введите его в клетку. Если электрод не сломался, его можно использовать повторно.

Внутриклеточная регистрация позволяет измерить ионную основу потенциала действия и определить характерную форму потенциалов для изучения эффектов мутаций ионных каналов или модификаторов каналов. Таким образом, мы продемонстрировали вам методы регистрации сердечной деятельности, а также способы снятия внутриклеточных и полевых потенциалов. Эти методы можно использовать для анализа изменений в работе сердца, а также для изучения результатов фармакологических манипуляций и генетических модификаций.

При выполнении данной процедуры важно не тянуть за структуры, прикрепленные к сердцу, и не слишком сильно давить фокальным электродом. Кроме того, при использовании метода склеивания следует следить за тем, чтобы не заклеить ротовое отверстие или сферический затвор. На этом все.

Спасибо за просмотр и удачи в проведении ваших экспериментов.