Мониторинг функции сердца в личинок Дрозофилы Для физиологических исследований

Drosophila являются генетически привлекательным объектом для исследования развития и функций сердца, а также лежащей в их основе активности пейсмейкера. В данной процедуре показано, как готовить препараты как целых, так и препарированных личинок, а также как контролировать частоту сердечных сокращений. Препарированный образец также позволяет регистрировать внеклеточные или внутриклеточные потенциалы для дальнейшего изучения функции ионных каналов.

Здравствуйте, я Робин Купер, преподаватель кафедры биологии Университета Кентукки. Сегодня мои студенты — Энн Купер, Кайла Райман, Мэтт Уорд и Истер Боку — продемонстрируют вам различные процедуры мониторинга частоты сердечных сокращений у личинок Drosophila. Следующий метод исследования животных в свободном состоянии называется «муравьиная ферма», поскольку личинки визуализируются в одной фокальной плоскости.

Для наилучшей визуализации личинок используйте диссекционный микроскоп с базовым объективом 2x и тубусным объективом 0.5x, что обеспечит оптимальное пространственное разрешение и увеличение на прямоугольнике размером 1 см на 0.5 см. Фотографии и видео можно записывать с помощью камеры, установленной в окулярное крепление. Чтобы начать выполнение данного метода, поместите личинку с тонким слоем корма между двумя предметными стеклами.

Предметные стекла удерживаются на расстоянии от 1 до 1,5 миллиметров с помощью пластиковых проставок со всех четырех сторон. Наклоните препарат под углом от 20 до 45 градусов на несколько минут, чтобы личинка держала голову направленной вниз. Отрегулируйте зеркало микроскопа для достижения наилучшего контраста сердца или двух трахей, чтобы наблюдать за сердцебиением.

Метод приклеивания представляет собой способ постоянной фиксации личинок на предметном стекле. Для начала этого метода поместите чистую покровную пластинку поверх предметного стекла. Нанесите небольшую каплю суперклея на один из углов покровной пластинки.

Затем промойте личинок водой. Чтобы удалить остатки корма, впитайте жидкость салфеткой или краем бумажного полотенца. После тщательного промывания личинки осторожно перенесите её чистым пинцетом на предметное стекло под микроскоп, расположив в стороне от покровного стекла, брюшной стороной вниз.

На желудке будут видны слабые горизонтальные бороздки с тонкими черными волосками. Спинка личинок должна быть обращена вверх; на ней видны две продольные полосы, представляющие собой трахеи. Используя второй пинцет, предназначенный исключительно для работы с клеем, возьмите небольшое количество клея из капли на конце предметного стекла и нанесите его на угол с противоположной стороны.

Используйте минимальное количество клея, достаточное только для того, чтобы покрыть кончик пинцета. Подхватите животное и поместите его на клей, убедившись, что оно зафиксировано брюшной стороной вниз к черному отверстию.

Крючки должны находиться на краю или рядом с краем покровного стекла: ротовые крючки и коричневая спираль. Они не должны касаться клея. Осторожно прижмите личинку, чтобы распрямить её.

Для нанесения исследуемого вещества рекомендуется с помощью шприца вводить небольшие капли рядом с головой личинки. Оценивайте частоту сердечных сокращений, подсчитывая количество пульсаций спиралей за одну минуту. При длительных наблюдениях личинок можно кормить на месте и увлажнять для предотвращения обезвоживания. Чтобы изготовить диссекционную пластинку, пригодную для использования под микроскопом, скальпелем прорежьте отверстие диаметром два сантиметра в центре фрагмента магнитного скотча и приклейте его к предметному стеклу.

Для более удобного закрепления используйте препаровальные иглы, согнутые и приклеенные к канцелярским скрепкам. В процессе препарирования поместите неповрежденную личинку третьего instar в форме звезды на препаровальную пластину. Расположите личинку спинной стороной вверх, чтобы трахея была видна сквозь кутикулу.

Поместите две булавки в личинку по обе стороны от ротовых крючков и еще две булавки по обе стороны от спиралей. Затем добавьте физиологический раствор, чтобы личинка оставалась увлажненной. После этого сделайте горизонтальный разрез у заднего конца, а затем продольный разрез, который должен проходить вдоль спиралей в направлении головы животного.

Приподнимите одну дорсальную булавку и зацепите её под кутикулу. Используйте булавку, чтобы раздвинуть ткани. Вскройте полость тела.

Повторите процедуру с остальными тремя булавками. После того как тело животного будет зафиксировано в раскрытом состоянии, аккуратно извлеките внутренние органы, стараясь не повредить трахею или сердце. Некоторые структуры, включая мозг и жировые тела, прикреплены к сердцу, и их удаление может привести к его повреждению.

Дайте препарату отдохнуть в растворе HL 3 в течение трех-пяти минут после диссекции; внутриклеточная и экстрацеллюлярная регистрация в данном препарате проводится при непосредственном воздействии фармакологических агентов на сердце. Общее время этого этапа диссекции составляет от трех до шести минут. Для проведения электростимуляции сначала необходимо изготовить фокальные электроды: для этого стеклянный электрод нагревают на heating element для огневой полировки и делают плавный изгиб примерно под углом 45 градусов, затем фокальный электрод, заполненный раствором HL 3 комнатной температуры, устанавливают в манипулятор концом вниз.

Убедитесь, что провод стимулятора касается физиологического раствора внутри электрода и что стимулятор выключен. Закрепите свежий препарат препарированного сердца на микроскопе. Поместите заземляющий провод в физиологический раствор.

Будьте осторожны, чтобы не задеть контакты и не нарушить целостность препарата. Сохраняйте фокус на электроде, используя манипулятор для его перемещения вниз, в физиологический раствор. Оказавшись в растворе, расположите кончик электрода так, чтобы просвет был прижат к сердцу и слегка касался его.

После установки электрода установите частоту стимулятора на 2 Hz, выставив минимальное значение напряжения. Включите стимулятор. Настройте частоту примерно на 3 Hz и медленно увеличивайте напряжение до тех пор, пока частота сердечных сокращений не ускорится и не синхронизируется с ритмом стимулятора.

Теперь ритм можно регулировать с помощью стимулятора. Можно добавлять различные соединения, чтобы проверить их влияние на сократимость или электрическую проводимость. Для регистрации внеклеточного потенциала заполните записывающий электрод для макропатчей промывочной средой и закрепите его в манипуляторе на сложном микроскопе.

Подключите электрод к усилителю и системе регистрации данных. С помощью манипулятора опустите просвет электрода над сердцем препарированного объекта, закрепленного на микроскопе. Очень осторожно коснитесь сердца кончиком электрода.

Теперь можно провести внеклеточные регистрации для записи полевых потенциалов из другого отдела сердца. Осторожно поднимите кончик электрода и переместите его в новую область с помощью манипулятора, затем снова начните регистрацию полевых потенциалов. Это позволит точно контролировать частоту и длительность электрических сигналов в сердце для измерения трансмембранных потенциалов миоцитов личинок.

Сначала убедитесь, что просвет острого электрода, заполненного 3 M раствором хлорида калия, прилегает к сердцу под углом примерно 45 градусов по отношению к вертикали. После правильного позиционирования аккуратно прикоснитесь кончиком электрода к сердцу и введите его в клетку. Если электрод не сломался, его можно использовать повторно.

Внутриклеточная регистрация позволяет измерить ионную основу потенциала действия и изучить характерные формы потенциалов для анализа эффектов мутаций ионных каналов или модификаторов каналов. Таким образом, мы продемонстрировали вам способы регистрации сердечной активности, а также методы записи внутриклеточных и полевых потенциалов. Эти методы можно использовать для изучения изменений в работе сердца, а также для анализа фармакологических манипуляций и генетических модификаций.

При выполнении данной процедуры важно не тянуть за структуры, прикрепленные к сердцу, и не оказывать чрезмерного давления фокальным электродом. Также при использовании метода склеивания следует быть осторожным, чтобы не заклеить рот или сферический затвор. На этом всё.

Спасибо за просмотр, и удачи в проведении ваших экспериментов.