Микрообъеме концентрации белка Определение использованием NanoDrop 2000c Спектрофотометр

Технология NanoDrop сочетает в себе волоконную оптику и поверхностное натяжение для удержания и измерения небольших количеств образцов, таких как нуклеиновые кислоты и белки. Небольшая капля образца пипетируется непосредственно на нижний пьедестал. Затем верхний оптический пьедестал зацепляет образец, образуя колонну.

Пьедестал автоматически перемещается для регулировки оптимальной длины пути. Сокращение длины пути устраняет необходимость в разведении для большинства образцов белка, измерение происходит за секунды, а результаты по спектру отображаются на экране. Здравствуйте, меня зовут Линн Калхорн, я работаю в лаборатории NanoDrop компании Thermo Fisher Scientific.

Сегодня мы покажем процедуру определения концентрации белка с помощью инновационного микрообъемного спектрофотометра. NanoDrop 2000 C. Спектрофотометр NanoDrop 2000 C использует инновационную систему удержания образцов, которая полагается на поверхностное натяжение жидкостей для удержания и измерения микрообъемных образцов между двумя оптическими пьедесталами без использования кювет или капилляров. Микрообразец помещается непосредственно на поверхность обнаружения, а между концами оптических волокон создается столб жидкости под действием поверхностного натяжения.

Этот столб жидкости образует вертикальный оптический путь. Ксеноновая лампа-вспышка служит источником света, а спектрометр с линейной ПЗС-матрицей используется для анализа света, проходящего через образец. Удаление из системы традиционных защитных устройств, таких как кюветы, имеет ряд преимуществ.

Для измерения требуется очень небольшое количество образца. Для очистки от одного до двух микролитров необходимо просто протереть оптические поверхности лабораторной салфеткой, а длина пути автоматически изменяется в режиме реального времени во время измерения. Кроме того, сокращение длины пути позволяет измерять более высокие концентрации, что эффективно устраняет необходимость в разведении для большинства образцов белка.

В случаях, когда ветеринарный врач оправдан, например, при кинетических исследованиях, NanoDrop 2000 C предоставляет возможность проведения ветеринарных исследований в том же спектрофотометре. Для этого протокола мы будем использовать опцию пьедестала микрообъема для определения концентрации белка. Метод белка А-2-80 применим к очищенным белкам, которые содержат остатки триптофана, тирозина и фенилаланина или сульфидные связи цистеинацистеина дисса и демонстрируют абсорбцию при длине волны 280 нанометров.

Чтобы начать эту процедуру, выберите в главном меню применение белка А два 80. Если появится окно проверки длины волны, убедитесь, что рука опущена, выберите тип образца для измерения из раскрывающегося списка. Настройка по умолчанию рекомендуется для большинства неизвестных белковых смесей, в которых один ABSORBENCE равен одному миллиграмму на миллилитр.

При измерении ранее охарактеризованного очищенного белка можно ввести либо коэффициент массового экстинкции, либо коэффициент молярного экстинкции. Чтобы более точно определить концентрацию белка, выберите единицы концентрации из выпадающего списка, расположенного рядом с цветовым полем. Затем установите бланк.

Используя соответствующий буфер, важно использовать буфер, в котором белок суспендирован. Используемый буфер должен иметь тот же pH и такую же ионную силу, как и раствор образца. Из-за изменчивости поверхностного натяжения между различными белками мы рекомендуем загружать два микролитра образцов, чтобы обеспечить правильное формирование колонки.

Для загрузки коснитесь наконечника пипетки с низким удержанием нижней поверхности пьедестала во время выталкивания раствора, чтобы предотвратить прилипание раствора к внешней стороне наконечника пипетки, выдавите меньше полного количества образца, чтобы предотвратить выдувание и попадание пузырьков в образец. Как только образец будет загружен, опустите кронштейн и нажмите пусто. Когда заглушка будет завершена, сотрите раствор с нижней и верхней опор.

Используя сухую лабораторную салфетку перед взятием аликвоты для измерения, важно убедиться, что образец однороден. Осторожно, но тщательно перемешивайте образец, осторожно перемешивая его с использованием средних оборотов, чтобы избежать попадания микропузырьков в жидкость. Введите идентификатор образца в соответствующее поле.

Загрузите два микролитра первого образца, как показано ранее для заготовки, опустите кронштейн и нажмите кнопку «Измерить» Когда измерение будет завершено, сотрите образец с нижней и верхней подставок. Используя сухую лабораторную салфетку, измерьте все остальные образцы таким же образом, используя свежую аликвоту в два микролитра образца для каждого измерения. Обычной безворсовой лабораторной салфетки часто бывает достаточно для очистки оптических пьедесталов между измерениями.

Единственным растворителем, который несовместим и не должен использоваться, являются растворы фтористоводородной кислоты, а реагенты, содержащие поверхностно-активные вещества, могут со временем выводить из строя поверхности пьедестала измерения, препятствуя образованию столба жидкости образца. Сплющение капли на нижней опоре указывает на то, что оптическая поверхность становится непригодной для восстановления. Поверхности пьедестала либо энергично отполировать с помощью лабораторной салфетки, либо предпочтительным методом является использование восстанавливающего компаунда для пьедестала NanoDrop PR в соответствии с указаниями.

Если образец представляет собой нехарактерный раствор белка, лизат клеток или экстракт сырого белка, мы рекомендуем использовать один из предварительно настроенных колорметрических методов, доступных на NanoDrop 2000 C. Эти колорметрические методы включают в себя шесть анализов BCAP 60 Брэдфорда и Лоуи. Здесь будет продемонстрирован анализ BCA. Необходимые реагенты для анализа БЦА содержатся в термосе, совместимом с набором восстановителя прокалывания BCA, реагенте A, B, C, A, реактиве B и стандартах бычьего сывороточного альбумина.

Мы будем использовать предварительно разбавленный набор альбумина Пирса, поскольку наши стандарты ссылаются на литературу по Пирсу BCA, чтобы определить, какие стандарты анализа подходят для ваших обстоятельств. Для приготовления реагентов сначала уравновесьте все неизвестные белки и белковые нормы до комнатной температуры и тщательно перемешайте путем осторожного вортекса. Используйте средние обороты, чтобы избежать попадания микропузырьков в жидкость.

Так как пузыри могут негативно повлиять на показания. Подготовим достаточное количество свежего рабочего реагента для эталонов и образцов, подлежащих измерению, с использованием соотношения реагента А к B.In этом примере мы приготовим три миллилитра рабочего реагента, чтобы покрыть эталонные пять эталонов и шесть образцов. Обычный анализ BCA охватывает более широкий динамический диапазон и использует соотношение реагентов к белку 20 к одному, в то время как микроанализ BCA более чувствителен и имеет более узкий динамический диапазон при использовании соотношения реагента к белку один к одному.

Поскольку мы проводим обычный анализ BCA, мы подготовим соотношение рабочего реагента к образцу 20 к одному. Добавьте 190 микролитров рабочего реагента в каждую пробирку, чтобы покрыть все образцы и стандарты. Далее добавьте по 10 микролитров стандарта или образца в каждую из пробирок, содержащих реагент.

Хорошо перемешайте легким вортексом. Инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После инкубации дайте реакциям сбалансироваться до комнатной температуры в течение примерно 10 минут.

В отличие от метода белка А 2 80, метод белка BCA требует построения стандартной кривой до того, как можно будет измерить концентрацию белка в образце. Чтобы построить стандартную кривую, начните с выбора метода белка BCA в главном меню. Если появляется окно проверки длины волны, убедитесь, что рука опущена.

Введите значения для каждой стандартной концентрации в таблице на правой панели. Программное обеспечение позволяет использовать справочные и до семи дополнительных стандартов. Эталоны и/или стандарты могут быть измерены в повторах.

Установите пробел с помощью соответствующего буфера. Бланк для цветовых метрических анализов обычно деионизируется. Намочите пипеткой два микролитра воды на нижнюю тумбу и опустите руку.

Нажмите пусто. Для покрытия всех последующих измерений эталона и эталона необходим только один бланк. Установите эталон, пипетируя двухлитровую Eloqua только рабочего реагента и буфера без белка на нижний пьедестал.

Опустите кронштейн и нажмите кнопку Измерить. На вкладке стандартов выделите нужный стандарт и нанесите пипеткой два микролитра нужного стандарта на нижний постамент. Опустите кронштейн и нажмите кнопку Измерить.

Повторите процесс для всех стандартов. Чтобы просмотреть стандартную кривую, нажмите кнопку Просмотреть стандартную кривую. После того, как все эталоны будут измерены, нажмите на кнопку с образцами.

Введите идентификатор образца, загрузите два микролитра образца на нижний постамент и нажмите измерить. Для каждого измерения следует использовать свежую аликвоту образца в два микролитра. Когда измерение будет завершено, протрите образец с нижней и верхней опор сухой лабораторной салфеткой.

Затем получается результат, так как конечная концентрация образца автоматически рассчитывается с помощью стандартной кривой. Мы только что показали два способа определения концентрации белка: либо прямым измерением двух 80, либо косвенным цветовым метрическим методом, каждый из которых используется микрообъемным спектрофотометром NanoDrop 2000 C. Это всё.

Спасибо за просмотр.