Вывод гемопоэтических стволовых клеток мышей эмбриональных стволовых клеток

Первым делом мы берем конфлюентную культуру umsl в T 25 флаконе. Я промою её PBS, затем добавлю несколько капель трипсина и оставлю на пару минут. Я вижу, что клетки начинают открепляться от поверхности флакона, так что они практически готовы.

Итак, теперь я приступлю к сбору трипсинизированных клеток; рекомендуется подвергнуть их кратковременному воздействию трипсина, чтобы разрушить клеточные колонии перед их переносом на чашку с среду. После этого образцы будут находиться в инкубаторе примерно 30–45 минут. Теперь я центрифугирую эти клетки для их осаждения, а затем удалю супернатант с помощью аспиратора.

Я приступлю к ресуспендированию через несколько минут, чтобы иметь возможность провести подсчет. Таким образом, я ресуспендировал суспензию, провел подсчет и теперь беру аликвоту. Я доведу объем этой аликвоты до 50 мл, чтобы получить соответствующую концентрацию — сто клеток на каплю, чтобы убедиться, что клетки в порядке. Теперь у нас есть резервуар.

Снова слегка перемешайте содержимое, затем перелейте его в резервуар. Итак, программа уже установлена. Готово.

Теперь оно распределено ровно. Переверните и отставьте в сторону. Каждые несколько планшетов я слегка наклоняю их, чтобы содержимое немного перемешалось.

Итак, получилось пять планшетов. Теперь я помещу их в инкубатор. Это наши висячие капли, которые мы подготовили два дня назад.

Таким образом, для сбора достаточно встряхнуть планшеты, чтобы собрать капли. Я соберу весь объем, стараясь делать это осторожно, чтобы не слишком повредить EV; я просто добавлю пять или шесть объемов PBS и промою планшеты. Затем мы оставим их минимум на 10 минут, чтобы EV осели под действием силы тяжести.

После визуального подтверждения того, что ваши EBS осели, удалите большую часть супернатананта, но не весь, чтобы не нарушить их расположение. Хорошо. Теперь их встряхивают до шестого дня. Перед нами эмбриоидные тельца, подготовленные шесть дней назад из мышиных эмбриональных стволовых клеток; обычно при их сборе мы слегка вращаем планшеты.

При вращении планшетов клетки собираются в центре лунки, что немного облегчает их центрирование. Теперь дайте клеткам осесть на дно пробирки под действием силы тяжести, после чего удалите среду и один раз промойте 10–12 мл PBS. Хорошо, теперь подождем минуту.

Теперь я просто удалю P. Мы добавляем 250 µL нашей смеси ферментов и добавляем милли, а затем помещаем их в водяную баню при 37 °C. Время от времени, возможно, пару раз, я буду подходить и слегка встряхивать их для перемешивания, так как Ed осел. Теперь у нас есть этот буфер для диссоциации клеток без ферментов, который мы получаем от gpro.

Мы добавим примерно 8 мл этого раствора в каждую пробирку. Затем, используя дозатор на 5 мл, мы будем перемешивать содержимое для диссоциации; по мере перемешивания и диссоциации раствор станет очень мутным. Это служит визуальным индикатором того, что клетки распределяются в среде, делая её мутной. Теперь я подсчитаю количество клеток методом исключения трипанового синего; если вы планируете проводить инфицирование или рассчитывать MOI, подсчет клеток крайне важен.

Я приготовлю большой объем смеси из вируса, среды, клеток в соответствующей концентрации и сульфата белка. Затем я убеждаюсь, что клетки находятся в суспензии — я всегда очень внимательно слежу за этим. Также я стараюсь избегать чрезмерного разбрызгивания и центрифугирую смесь при 2 500 rpm.

Таким образом, я собираю наши клетки на 10-й день; все промывочные растворы я сохраняю. Раньше я использовал PI (пропидий иодид), но 7-AMK не дает такого яркого свечения. Благодаря этому он меньше перекрывается с другими каналами, что обеспечивает более чистый результат.

Теперь мы просто берем переменную, и это хороший способ предотвратить потерю объема в игле. Меня зовут Шеннон Маккинни Фриман, я постдокторант в лаборатории Джорджа Фэмилис в Детской больнице Бостона.

Сегодня мы разберем, как получить популяцию трансплантируемых клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши для восстановления гемопоэтической системы. Зачем мы проводим этот эксперимент? Известно, что с помощью данной системы можно получить — прежде всего, этот протокол был разработан для получения из эмбриональных стволовых клеток популяции клеток, обладающих активностью гемопоэтических стволовых клеток в том смысле, что они способны спасать мышей после летального облучения, восстанавливая их гемопоэтическую систему на длительный срок, в течение всей жизни организма, и по всем линиям периферической крови.

Именно поэтому был разработан данный протокол. Сейчас мы проводим дальнейшие эксперименты, чтобы понять фенотип популяции клеток внутри этой расширенной популяции, которую мы получаем и которая фактически опосредует активность гемопоэтических стволовых клеток. Поскольку нам это неизвестно; мы знаем, что популяция очень неоднородна и что клетки, которые фактически спасают мышей, крайне редко встречаются в этой популяции клеток.

Таким образом, мы пытаемся в основном определить его фенотип, чтобы иметь возможность очистить его из этих очень гетерогенных клеток. Далее нас больше всего интересует понимание того, как он функционально соотносится с истинной гемопоэтической стволовой клеткой, которую можно выделить из цельного костного мозга. Обладает ли она равной способностью к реконституции в процессе развития, отражает ли она характеристики HSC взрослого костного мозга?

Или, возможно, она будет больше похожа на гемопоэтическую стволовую клетку. Вы можете обнаружить её на ранних стадиях развития, например, в зачатке селезенки или в фетальной печени. В конечном счете, именно это мы и пытаемся понять; нам нужны ответы на эти вопросы, так как мы хотим, чтобы данный протокол послужил основой для аналогичных исследований, которые мы планируем провести с человеческими эмбрионами стволовыми клетками.

Мы полагаем, что информация, которую мы получим с помощью этой математической системы, принесет огромную пользу будущим экспериментам. Думаю, здесь есть несколько важных моментов. Прежде всего, это отличная модель in vitro и подходящая модель развития in vivo.

Прежде всего, мы пытаемся понять процесс развития гемопоэтических стволовых клеток. Эта система удобна тем, что она минимальна по отношению к эктопической экспрессии генов, что позволяет изучать влияние этих факторов на развитие гемопоэтических стволовых клеток. С точки зрения фундаментальной науки это весьма полезно.

Но в конечном итоге мы стремимся разработать своего рода клеточную терапию, которую можно было бы использовать в клинике для получения, так сказать, трансплантируемых метаболических стволовых клеток из человеческих клеток. Но это, вероятно, произойдет в отдаленном будущем. На самом деле, мы обнаружили, что самой трудной частью является не столько получение самих клеток; путем тщательного экспериментирования мы выяснили, что был период времени, когда у нас возникали трудности с тем, чтобы клетки восстанавливали организм животных-реципиентов.

В итоге мы обнаружили, что необходимо очень внимательно подойти к абляции реципиентов, поскольку эти клетки не обладают достаточным потенциалом. Как правило, при проведении трансплантации мышам с использованием костного мозга, полученного от животных с дефицитом agec, применяют облучение в дозе 10 или 11 грей для абляции мышей, и гемопоэтические стволовые клетки костного мозга вполне способны восстановить состояние животных после этого. Однако оказалось, что эта популяция клеток, которую мы экспансируем, не способна спасти животных после столь высокой дозы ионизирующего излучения.

Таким образом, нам пришлось очень тщательно титровать дозу облучения, учитывая размер животных. Мы обнаружили, что если животные были слишком крупными и мы пытались использовать ту же дозу, абляция проводилась недостаточно эффективно. С другой стороны, при недостаточном облучении животных клетки оказываются неспособны конкурировать с более резистентными хозяевами.

Таким образом, как только мы поняли, что это был основной фактор, затрудняющий наблюдение за активностью этих клеток, и провели титрование дозы облучения, а также осознали значительное влияние возраста и веса животного, наши эксперименты стали воспроизводимыми. Мы обнаружили, что если использовать животных весом около 20 г (от 15 до 20 г) и проводить абляцию дозой 9.25 Gy, то эта доза оказывается оптимальной и дает клеткам необходимое преимущество для восстановления организма мышей. Да, я считаю, что это была одна из самых важных переменных.

Еще одним крайне важным аспектом является количество инъецируемых клеток. Мы также определили титр при использовании данных конкретных условий облучения нашего модельного организма. Кроме того, мы определили титр этого нефракционированного, гетерогенного пула клеток, которые мы вводили мышам.

В итоге мы обнаружили, что для спасения животных требуется минимальная доза примерно от 2 миллионов до 5 миллионов клеток. Если ввести меньшее количество, животные не восстанавливаются. Я полагаю, это указывает на то, что за спасение в этом гетерогенном компартменте, вероятно, отвечает редкая популяция клеток.

Поэтому я считаю, что наиболее важными переменными являются количество инъецируемых клеток и уверенность в том, что в какой бы модели трансплантации вы ни использовали, вы подвергли их облучению в достаточной степени, чтобы дать клеткам необходимое преимущество для реконституции, но не настолько сильно, чтобы они просто были неспособны обеспечить восстановление.