Быстрое высокой пропускной метод картирования рибонуклеопротеиды (мяРНП) по правам пре-мРНК

Чтобы картировать сайты связывания ядерных белков рибо на пре-мРНК, начните с разбиения на выделенную область интересующей области ННК према в 30 нуклеотидных окнах и синтезируйте мозаичные олигосеты на массиве. Олигопласты вывариваются из массива и осаждаются с интересующим их РНП. Общий начальный пул помечается SCI три, а связанный пул помечается SCI пять, и оба они применяются к массиву обнаружения.

Затем массив сканируется, и программное обеспечение для извлечения признаков используется для интерпретации результатов. Соли. Привет, я Кейт Уоткинс из лаборатории брата Уилла Фэйра на факультете MCB в Университете Брауна. Сегодня я покажу вам быструю и недорогую процедуру определения точного расположения белкового комплекса РНК на прем РА в лабораторных условиях, реактивируя прем А в виде пула перекрывающихся олигонуклеотидов.

Затем этот пул может быть разделен на связанную и несвязанную фракции с помощью соиммунопреципитации, а затем проанализирован с помощью микрочипа. Хотя эта процедура имеет множество применений, мы используем ее для изучения нескольких факторов сплайсинга, их роли и альтернативного сплайсинга. Итак, приступим.

Чтобы начать эту процедуру, используйте браузер генома uc SC для загрузки определенных генов, сплайс-соединений или других областей, представляющих интерес, из которых можно спроектировать пул prem A. Выберите интересующие вас окна, затем вычислительно расположите их мозаикой с длиной чтения 30 нуклеотидов и перекрытием 20 нуклеотидов так, чтобы каждый олиго был смещен на 10 нуклеотидов от предыдущего. Теперь, когда 30 нуклеотидных длинных олигонотидов определены, каждый из них окружен универсальными последовательностями праймеров.

Отправьте олигонуклеотиды в компанию Agilent для печати на специальном олигонуклеотидном микрочипе. Как только микрочип прибудет, начните извлекать олигопласты ДНК с его поверхности, поместив предметное стекло в камеру для гибридизации матрицы и аккуратно нанеся на предметное стекло 500 микролитров деионизированной воды. Поместите предметное стекло микрочипа лицевой стороной вниз на предметное стекло так, чтобы этикетки на каждом предметном стекле были обращены друг к другу, и следите за тем, чтобы не было пузырьков воздуха, которые могут нарушить процесс восстановления олиго.

Закройте камеру гибридизации и вращайте ее в течение ночи при температуре 99 градусов Цельсия в печи для гибридизации На следующий день осторожно выньте массив из камеры и удалите воду, которая теперь содержит олиго, высвобожденные с поверхности массива. Поместите бассейн высвобожденного олиго в 1,5-миллилитровую эйноровую трубку и обработайте ультразвуком, чтобы разбить потенциальные комки с амплитудой 50% три раза в течение трех-пяти секундных импульсов каждый раз. Затем амплифицируйте пул с помощью низкоцикловой ПЦР с использованием универсальных праймеров с добавленным к их концу Т-промотором.

Количество необходимых циклов может варьироваться в зависимости от эффективности олигоновосстановления. Избегайте чрезмерного усиления, которое видно в виде размазанной полосы на акриламидном геле. Наконец, используйте мега короткий набор скриптов от Amon для транскрибирования РНК.

Прекращают реакцию транскрипции экстракцией фенилхлороформа РНК с последующим осаждением этанола с использованием ацетата натрия и гликосиня в качестве носителя. Ресуспендировать РНК-гранулу в 105 микролитрах TE-буфера. Для точного определения концентрации РНК.

Используйте зеленый рибо для создания стандартной кривой. Затем измерьте с помощью считывателя флуоресцентных пластин. Пул РНК теперь готов к тому, чтобы коиммунопреципитация начала снижаться.

Во-первых, приготовьте магнитные шарики, соединив гранулы белка A и белка G dyna в соотношении один к одному до конечного объема 50 микролитров на реакцию. Сконцентрируйте шарики в одном месте с помощью магнитной разделительной стойки для того, чтобы удалить надосадочную жидкость. Затем постирайте дважды равным объемом холодного одного XPBS после второй стирки.

Восстановите, суспензируйте шарики в равном объеме холода одним XPBS и добавьте два нанограмма антитела к периону. Это количество может варьироваться в зависимости от антитела, поэтому может потребоваться экспериментирование, чтобы найти оптимальные условия для связывания антитела с гранулами. Инкубируйте смесь в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на вращающейся платформе.

Утром добавьте по два микрограмма на реакцию общей РНК дрожжей, чтобы блокировать неспецифическое связывание, и вращайте еще 30 минут при четырех градусах Цельсия. Как только этап блокировки будет завершен, снова используйте магнитную стойку для удаления надосадочной жидкости. Затем промыть бусины дважды холодной одной XPBS, оставив PBS от второй промыть в пробирке 50 микролитров смеси бусин в новые трубки.

По одной пробирке для каждой реакции co IP. Теперь бусины готовы для co ip. Затем приготовьте мастер-смесь, объединив пул олигоолигонов РНК с экстрактом ядерных клеток.

В качестве источника РНП возьмите 50 микролитров аликвоты мастер-смеси в качестве общей защиты образца Праймеры, которые являются РНК-версиями универсальных праймеров, могут быть добавлены для предотвращения связывания белка с последовательностью праймера или введения вторичной структуры в РНК. Чтобы запустить со-иммунопреципитацию, удалите надосадочную жидкость из аликвот шариков и повторно суспендируйте гранулы в 120 микролитрах оставшейся мастер-смеси. Прокачивайте реакцию при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного-двух часов.

В конце инкубации маленькая Eloqua, включая бусины, может быть удалена из каждого coip. Для дополнительной проверки эффективности или специфичности связывания поместите оставшуюся часть реакций на магнит и удалите надосадочную жидкость. Далее следует одна-две промывки холодной одной XPDS.

РНК, связанная с антителом на бусинах через RNP, является образцом IP. Повторно суспендируйте шарики IP в 50 микролитрах 1% SDS в буфере 0,1 XTE и нагрейте образцы при температуре 65 градусов Цельсия в течение 15 минут. Чтобы элюировать РНК, удалите надосадочную жидкость, которая теперь содержит РНК, ранее связанную с шариками, и очистите экстракцией фенилхлороформа с последующим осаждением этанола, повторно суспендируйте гранулу в 50 микролитрах 0,1 XT буфера.

Далее выполните обратную транскрибацию образцов с помощью обратных универсальных грунтов. Затем с помощью ПЦР амплигируют образцы универсальными праймерами, один из которых должен содержать промотор Т-7. Количество циклов, необходимых для усиления пула, будет зависеть от эффективности co ip.

Используя набор сценариев mega shorts от ambion, снова расшифруйте сэмплы, но на этот раз добавьте два микролитра аминоаллеля UTP вместо T seven UTP, который идет в комплекте. Аминоаллель UTP будет использоваться позже для маркировки РНК боковыми глазами. Когда расшифровка будет завершена.

Фенилхлороформный экстракт и этанол осаждают образцы. Не используйте гликосину или ацетат аммония, которые могут помешать гибридизации образцов с матрицей. Резус суспендируют в 4,5 микролитрах 0,1 молярного карбоната натрия.

Чтобы сначала пометить образцы, добавьте 2,5 микролитра воды, не содержащей нуклеаз, к общему образцу. Добавьте три микролитра S3 и к образцу IP на три микролитра SCI пять. Выдерживать в темноте в течение одного часа.

При комнатной температуре завершите реакцию, добавив в каждый образец шесть микролитров четырех молярных гидроксильных ламинов HCL, тщательно перемешайте и открутите. Кратковременно инкубируйте в течение 15 минут При комнатной температуре очистите маркированные образцы экстракцией фенилхлороформа с последующей осаждением этанола. Большая часть цвета погружается в органическую фазу со свободными нуклеотидами, поэтому гранулы могут быть незаметно окрашены.

Ресуспендируйте каждую гранулу в 50 микролитрах по 0,1 XTE. Следуйте инструкциям в наборе для гибридизации матриц Agilent для подготовки образца микрочипа за следующим исключением. Не фрагментируйте РНК После добавления буфера для фрагментации немедленно добавьте буфер для гибридизации, чтобы остановить фрагментацию.

Поместите образцы на решетку и гибридизируйте при температуре 50 градусов Цельсия в течение трех часов, пока решетка вращается. Приготовьте следующие 50 миллилитровые растворы в 50 миллилитровых конических тубах. Одна трубка с двумя избыточными буферами SC, две трубки с одним избыточным морским буфером и одна трубка с деионизированной водой.

После трехчасовой инкубации осторожно разжмите сэндвич с горилкой массива и поместите в буфер из двух XSSC. С помощью пинцета. Аккуратно отделите массив от предметного стекла крышки.

Аккуратно снимите крышку слайда, стараясь не касаться массива. Когда предметное стекло будет вытянуто, закройте конус и аккуратно переверните в течение 60 секунд. С помощью пинцета перенесите массив в одно XSSC решение.

Закройте трубку крышкой и аккуратно переверните в течение одной минуты. Затем переложите массив на второй XSSC раствор и снова, аккуратно инвертируйте еще минуту. Наконец, перенесите массив в трубку с деионизированной водой и аккуратно переверните в течение 30 секунд.

Высушите массив, поместив края предметного стекла на салфетку. Продолжайте вращать массив на салфетке, следя за тем, чтобы не повредить сторону, содержащую олиго. Поместите массив в пустую коническую трубу и приступайте к сканированию массива.

Перейдите к сканированию массива. Вот репрезентативный массив. Каждая функция или олиго окрашена либо в зеленый цвет для общего пула без обогащения, либо в красный цвет для пула, обогащенного IP.

Сигнал на каждой функции нормализуется в соответствии с общей интенсивностью в этом канале. Конечным результатом является логарифмическое отношение красного канала к зеленому каналу. Для каждого признака в массиве средний балл по каждой геномной координате отображается на заданное местоположение.

Иллюстрация этого шага усреднения приведена для трех перекрывающихся 30 нуклеотидных олигон с баллами два, четыре и 0,5, где показана средняя оценка обогащения для каждого окна из 10 нуклеотидов. Ниже приведен пример схемы связывания полиперинового отслеживаемого связывающего белка PTB в гене CLTA, признаки гена которого приведены внизу, а логарифмические средние баллы обогащения для PTP-связанного S представлены темно-красными вертикальными полосами. Светло-красными полосами обозначены области, которые не обогащены для привязки PTP.

Я только что показал вам, как быстро и эффективно создать пул олигонуклеотидов, который распределяет по областям интереса, таким как альтернативно нарезанные аксоны. Мы анализируем наши пулы с помощью микрочипов, но также возможно их секвенирование с помощью освещения, секвенирования по Лекси или более традиционного секвенирования по Сэнгеру. При выполнении этой процедуры важно помнить, что создание пула открыто для модификации либо на уровне РНК, либо на уровне белка.

На уровне РНК мы можем вводить аутологичные участки, мутации заболевания, полиморфизмы или случайные мутации в олигонуклеотидную последовательность. На белковом уровне фактор связывания РНК может быть модифицирован путем фосфорилирования или других посттрансляционных модификаций. Кроме того, средой связывания можно манипулировать для увеличения или уменьшения уровней дополнительных факторов, которые либо конкурируют с интересующим белком, связывающим РНК, либо взаимодействуют с ним.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.