Оптическая запись электрической активности в морских свинок Кишечные сети, используя напряжение чувствительных красителей

В данном видео демонстрируются препарирование и последующая визуализация электрически стимулируемых препаратов энтеральной нервной системы с использованием вольт-чувствительного красителя D-4-A-N-E-P-P-D-H-Q. Из эвтаназированной морской свинки берется небольшой сегмент кишечника, который препарируют для первоначального обнажения подслизистого слоя и, в конечном итоге, миэнтерального сплетения для проведения оптической регистрации. После получения исходного изображения высокого разрешения на закрепленную окрашенную D-4-A-N-E-P-P-D-H-Q ткань устанавливают электроды.

Оптические изменения, указывающие на электрическую активность, регистрируются с помощью высокоскоростной камеры. Во время высокоскоростной съемки подается электрическая стимуляция. Затем изображение высокого разрешения накладывается на карту пикселей высокоскоростной камеры для анализа с использованием neuro plex.

Здравствуйте, я Брайан Зальцберг, руководитель Лаборатории клеточной оптики (Laboratory of Cellular Optics), или сокращенно LOCO, как мы ее называем, на кафедре нейронаук Пенсильванского университета. Меня зовут Аналия Обиде. Я также являюсь сотрудником Лаборатории клеточной оптики.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру регистрации электрической активности интактных нейронных сетей млекопитающих с использованием вольто-чувствительных красителей. Мы применяем этот метод для изучения нейронных связей внутри двух сетей и между ними, которые образуют энтеральную нервную систему, также называемую «вторым мозгом» или «мозгом кишечника». Итак, приступим.

Начните подготовку препаратов подслизистого сплетения и энтерического сплетения, вырезая тонкий кишечник морской свинки линии Hartley весом от 150 до 200 г или в возрасте двух-трех недель, которой была проведена анестезия изофлураном путем ингаляции и обезглавливание. Затем удалите содержимое кишечника, промыв просвет теплым оксигенированным раствором M1 99 DM. Отрежьте сегмент кишечника длиной от 8 до 10 см, обязательно соблюдая полярность.

Перенесите его в стеклянную чашку диаметром 10 сантиметров с покрытием из сардона, содержащую среду M1 99 DM комнатной температуры. Поместите чашку под диссекционный микроскоп с темнопольным освещением. Затем с помощью ножниц раскройте брыжеечный край и закрепите сегмент кишечника энтомологическими булавками слизистой стороной вверх.

Крайне важно поддерживать равномерное натяжение, чтобы после закрепления ткань имела прямоугольную форму с регулярно выровненными рядами слизистой оболочки; при этом тонкие пинцеты Dumont с прямыми кончиками следует держать в почти горизонтальном положении. Отделите слизистую оболочку, захватив её в одном конце кишечного сегмента и потянув вдоль продольной оси ткани. Продолжайте отделять полоски слизистой оболочки, чтобы обнажить подслизистый слой, содержащий подслизистые ганглии и сосуды подслизистой оболочки.

Затем с помощью очень тонких ножниц сделайте разрез в подслизистом слое вдоль ориентации циркулярных мышечных волокон. После этого очень осторожно приподнимите подслизистый слой тонкими пинцетом, одновременно прижимая слой циркулярных мышц ножницами, и произведите разрез вдоль продольных краев.

По мере разделения отделяйте подслизистый слой от остальной части препарата. Теперь сделайте второй разрез вдоль ориентации циркулярных мышечных волокон на расстоянии от 1.5 до трех сантиметров от первого разреза, чтобы определить окончательный размер подслизистого препарата; полученный сегмент подслизистого слоя имеет толщину от 30 до 50 мкм и выглядит как тонкая паутина. Перенесите его в другую чашку Sylgard со свежей средой M1 99 DM и осторожно закрепите булавками без натяжения.

Затем поместите чашку в оксигенационную камеру при комнатной температуре для последующего использования. На данный момент исходный сегмент кишечника должен быть очищен от слизистой и подслизистой оболочек, а циркулярная мышца должна быть обнажена. Этот сегмент теперь используется для получения препарата миэнтериального сплетения с целью его визуализации.

Максимально удалите слой циркулярных мышц, используя тонкий прямой пинцет, чтобы отделить пучки волокон с каждой стороны препарата. Обнаженный миэнтерический сплетение невозможно отделить от продольного слоя мышц и лежащего под ним CI. Перенесите препарат миэнтерического сплетения в новую чашку с покрытием из сарда, содержащую оксигенированный раствор M1 99 M. Затем осторожно закрепите иглами образец, содержащий живую мышечную ткань. За несколько минут до начала оптического эксперимента перенесите препарат в новую, меньшую чашку с покрытием из syl guard, уже заполненную раствором M1 99 DM с содержанием 2 мкM nefe для предотвращения сокращения мышц, и надежно зафиксируйте его, аккуратно установив несколько очень тонких игл по периметру.

Убедитесь, что натяжение распределено равномерно, а ткань плотно прилегает к дну силиконовой подложки. Таким образом, препарат ткани готов к физиологическим экспериментам. В стеклянном флаконе, обернутом алюминиевой фольгой, приготовьте стоковый раствор DAI four A-N-E-P-P-D HQ в концентрации от 5 до 50 µg/mL в среде M1 99 M с добавлением 2 µM нифедипина.

Содержание этанола из стокового раствора в растворе M1 99 DM с нифедипином, которым был покрыт препарат, должно составлять менее 0.5%; замените его приготовленным раствором красителя. Используя достаточный объем красителя для полного покрытия ткани, инкубируйте препарат при комнатной температуре от 10 до 30 минут после инкубации. Промойте препарат оксигенированным раствором M1 99 M с нифедипином, полностью заменив содержимое камеры.

Оптическая регистрация нейронной активности в электрически стимулируемых препаратах выполняется с помощью системы, состоящей из вертикального эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного разделителем изображения, прецизионной высокоскоростной камерой низкого разрешения, черно-белой камерой высокого разрешения, управляемым компьютером генератором стимулов и микроманипулятором. Весь аппарат установлен на активном виброизоляционном столе и окружен тяжелыми акустическими шторами и крышей из майлара для минимизации вибраций, передающихся по воздуху. Хотя сбор изображений с обеих камер может осуществляться с помощью одного компьютера под управлением Neuroplex и Global Lab Image Two или любого другого программного обеспечения для сбора изображений, в данной установке для проведения оптических экспериментов используются два компьютера, каждый из которых управляет отдельной камерой.

Поместите кювету с окрашенным образцом на предметный столик микроскопа. Поскольку D four A и EPPD HQ являются мембранно-непроницаемыми красителями, которые флуоресцируют только в липидной среде, здоровые нейроны в окрашенном препарате кишечного сплетения при любом увеличении более 20 x должны выглядеть как пустые воздушные шары. Используйте фильтры HQ 5 35 50 для возбуждения, HQ 5 72 LP для эмиссии и дихроичное зеркало 5 65 nanometer.

Затем с помощью органов управления микроманипулятора установите многоканальный линейный матричный электрод у орального конца ткани, убедившись, что электрод не касается объектива микроскопа. Линейная матрица, содержащая 10 вольфрамовых электродов, распределенных на отрезке в один сантиметр, позволяет возбуждать несколько независимых нейронных путей и хорошо подходит для изучения взаимосвязанных ганглионарных цепей. Однако для получения репрезентативных данных мы использовали самодельный стимулирующий электрод с двумя отводами.

Используйте липкий воск, чтобы разместить заземляющий электрод на противоположном конце камеры; перед началом функциональной записи получите черно-белое изображение области, в которой будет регистрироваться электрическая активность, для облегчения визуализации. Градиент серого может быть инвертирован, чтобы флуоресценция выглядела темной. Чтобы подать стимулирующий ток с помощью управляемого компьютером генератора стимулов, сначала запрограммируйте устройство, выбрав соответствующую интенсивность, продолжительность, частоту и количество стимулов, а также задержку относительно начала сбора оптических данных.

Чтобы стимулирующее воздействие происходило в пределах окна сбора оптических данных, настройте генератор стимулов как устройство, управляемое через Neuro Plex. Затем установите параметры сбора данных в Neuro Plex, указав частоту кадров, количество кадров и усиление камеры. Для обеспечения полного разрешения потенциала действия частота кадров должна быть установлена минимум на 1 kHz.

Поскольку D four A и E-P-P-G-H-Q демонстрируют снижение флуоресценции при деполяризации, которое линейно связано с изменением напряжения, инвертируйте отображение оптических сигналов в neuro plex, чтобы потенциалы действия не выглядели перевернутыми. Начните сбор данных. Не забудьте получить новое черно-белое изображение высокого разрешения для каждого поля зрения перед проведением каждой функциональной записи.

После завершения сбора данных используйте Neuroplex для офлайн-анализа результатов. В области экрана, называемой page display, отображается исходное изображение препарата, зафиксированное высокоскоростной камерой 80x80, в виде отдельного кадра. При установке режима страницы absolute frame на изображение исходного кадра с помощью команд отображения Neuroplex накладывается изображение высокого разрешения, полученное со второй камеры, на пиксельную карту исходного изображения.

Для этого необходимо изменить режим страницы с «absolute trace» на «traces» и выбрать наложение изображения (superimposed image) в команде отображения. С помощью мыши выберите отдельные пиксели или группы пикселей на изображении, выведенном на страницу. Данные из этих областей интереса будут отображены в виде кривых в окне отображения трасс, что позволит определить величину оптических изменений, зарегистрированных этими пикселями, в зависимости от времени.

Инверсия серой шкалы на изображении высокого разрешения улучшает визуализацию на странице отображения в режиме трассировки; также настоятельно рекомендуется отображать аналоговый выход стимулятора. Выберите канал аналогового выхода для включения в окно отображения трассировки. Этот выход указывает точное время подачи стимулов во время эксперимента.

Чтобы просмотреть данные в виде фильма, используйте команды movie в программе neuro plex для отображения последовательных кадров набора данных с использованием псевдоцветных шкал, настроенных по максимальному и минимальному изменению интенсивности флуоресценции. Ганглий из препарата миэenteric сплетения, окрашенный DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q, был визуализирован с помощью камеры высокого разрешения и объектива 60x. Во время сбора данных препарат стимулировали серией из пяти импульсов с частотой 40 hertz.

При амплитуде каждого импульса 15 миллиампер и длительности 0,5 миллисекунды были определены четыре области интереса (ROI), и были построены графики для отображения оптических данных, усредненных по выбранным областям в последовательности псевдоцветных кадров; первые области оптического отклика на деполяризацию мембраны, указывающие на нейронную активность, выглядят от желтого до красного цвета. Эти данные свидетельствуют о том, что вызванная стимуляцией активность возникает в отдельных областях каждого ганглия и в основном обеспечивается проходящими аксонами. Области ROI 2, 3 и 4 представляют отдельные нейроны на различных расстояниях от ROI 1.

На рисунке два при 10-кратном увеличении показаны анатомические пути, по которым может распространяться информация; стрелки указывают направление движения стимула для активации определенного миентаерического ганглия. Мы только что продемонстрировали компоненты оптической установки для регистрации электрической активности с помощью вольтаж-чувствительных красителей и то, как применение этой технологии к внутринервной системе открывает возможность изучения функциональной связности внутри и между двумя интактными млекопитающими сетями непосредственно под микроскопом. При использовании технологии оптической регистрации крайне важно уделять внимание деталям.

Источники оптического, механического и электрического шума должны тщательно контролироваться, а жизнеспособность препарата — скрупулезно поддерживаться. Таким образом, освоение всех отдельных этапов данного протокола имеет решающее значение для успешного проведения оптической регистрации. Вот и всё.

Большое спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.