Оптическая запись электрической активности в морских свинок Кишечные сети, используя напряжение чувствительных красителей
4 декабря 2009 г.
Этот протокол иллюстрирует, как напряжение чувствительных красителей позволяет оптическая запись электрической активности из целых нейронных сетей, таких как сплетений морской свинки кишечной нервной системы, с регулируемой резолюцию, которая варьируется от одной клетки до нескольких ганглиозные схемы.
В данном видео демонстрируются препарирование и последующая визуализация электрически стимулируемых препаратов энтеральной нервной системы с использованием вольтаж-чувствительного красителя D-4ANEPP-DHQ. Небольшой сегмент кишечника извлекается из эвтаназированной морской свинки и препарируется для первоначального обнажения подслизистого слоя и, в конечном итоге, миэentericкого сплетения для проведения оптических записей. После получения первого изображения с высоким разрешением на закрепленную ткань, окрашенную D-4ANEPP-DHQ, устанавливаются электроды.
Оптические изменения, свидетельствующие об электрической активности, регистрируются с помощью высокоскоростной камеры. Во время высокоскоростной съемки подается электрическая стимуляция. Затем изображение высокого разрешения накладывается на карту пикселей высокоскоростной камеры для последующего анализа с помощью neuro plex.
Здравствуйте, я Брайан Сальцберг, руководитель Лаборатории клеточной оптики (Laboratory of Cellular Optics), или просто LOCO, как мы её называем, на кафедре нейробиологии Пенсильванского университета. Меня зовут Аналия Обиде, я также являюсь сотрудником Лаборатории клеточной оптики.
Сегодня мы продемонстрируем процедуру регистрации электрической активности в интактных нейронных сетях млекопитающих с использованием вольтаж-чувствительных красителей. Мы применяем этот метод для изучения нейронных связей внутри и между двумя сетями, составляющими энтеральную нервную систему, которую также называют «вторым мозгом» или «мозгом кишечника». Итак, приступим.
Начните подготовку препаратов подслизистого сплетения и энтерического сплетения путем вырезания тонкого кишечника морской свинки породы Hartley весом от 150 до 200 г или в возрасте двух-трех недель, которой была проведена анестезия изофлураном путем ингаляции с последующей декапитацией. Затем удалите содержимое кишечника, промыв просвет теплым оксигенированным раствором M199 DM. Отрежьте сегмент кишечника длиной от 8 до 10 см, обязательно соблюдая полярность.
Перенесите образец в 10-сантиметровую стеклянную чашку с сардовым покрытием, содержащую среду M1 99 DM комнатной температуры. Поместите чашку под диссекционный микроскоп с темнопольным освещением. Затем с помощью ножниц раскройте брыжеечный край и зафиксируйте сегмент кишечника энтомологическими булавками слизистой стороной вверх.
Крайне важно поддерживать равномерное натяжение, чтобы после закрепления ткань имела прямоугольную форму с регулярно выровненными рядами слизистых vll. Держа щипцы Dumont с прямыми кончиками в почти горизонтальном положении, отделите слизистую оболочку, захватив vll на одном конце кишечного сегмента и потянув вдоль продольной оси ткани. Продолжайте отделять полоски слизистой, чтобы обнажить подслизистый слой, содержащий подслизистые ганглии и сосуды подслизистого сплетения.
Затем с помощью очень тонких ножниц сделайте разрез в субмукозном слое, следуя направлению циркулярных мышечных волокон. После этого очень осторожно приподнимите субмукозу тонкими пинцетом, прижимая циркулярные мышцы вниз ножницами, и выполните разрез вдоль продольных краев.
По мере разделения отделяйте подслизистый слой от остальной части препарата. Теперь сделайте второй разрез вдоль циркулярных мышечных волокон на расстоянии от 1,5 до трех сантиметров от первого, чтобы определить окончательный размер подслизистого препарата; полученный сегмент подслизистой основы имеет толщину от 30 до 50 micrometers и выглядит как тончайшая паутинка. Перенесите его в другую чашку Sylgard со свежей средой M1 99 DM и осторожно закрепите булавками без натяжения.
Затем поместите чашку в оксигенационную камеру при комнатной температуре для дальнейшего использования. Теперь исходный сегмент кишечника должен быть очищен от слизистой и подслизистой оболочек, а циркулярная мышца должна быть обнажена. Данный сегмент теперь используется для получения препарата миenteric plexus с целью визуализации миenteric plexus.
Максимально удалите слой циркулярных мышц, используя тонкий прямой пинцет для оттягивания пучков волокон с каждой стороны препарата. Обнаженный миэнтерический сплетение невозможно отделить от продольного слоя мышц и подлежащего CI. Перенесите препарат миэнтерического сплетения в новую чашку с покрытием из сарда, содержащую оксигенированный раствор M1 99 M. Затем осторожно закрепите образец, содержащий живую мышечную ткань, с помощью булавок. За несколько минут до начала оптического эксперимента перенесите препарат в новую, меньшую чашку с покрытием из syl guard, уже заполненную раствором M1 99 DM с добавлением 2 µM nefe для предотвращения сокращения мышц, и надежно зафиксируйте его, аккуратно разместив несколько очень тонких булавок по периметру.
Убедитесь, что натяжение распределено равномерно и ткань плотно прилегает к дну силиконовой прокладки. Теперь препарат ткани готов к физиологическим экспериментам. В стеклянном флаконе, обернутом алюминиевой фольгой, приготовьте рабочий раствор DAI four A-N-E-P-P-D HQ в концентрации от 5 до 50 µg/mL в среде M1 99 M с добавлением 2 µM нифедипина.
Доля этанола из стокового раствора в растворе M1 99 DM с нифедипином, который покрывал препарат, должна составлять менее 0,5%; замените его приготовленным раствором красителя. Используя достаточный объем красителя для полного покрытия ткани, инкубируйте при комнатной температуре от 10 до 30 минут после инкубации. Промойте препарат оксигенированным раствором M1 99 M с NEFE, полностью заменив содержимое камеры.
Оптическая запись нейронной активности в препаратах с электрической стимуляцией осуществляется с использованием системы, состоящей из вертикального эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного разделителем изображения, высокоскоростной прецизионной камерой низкого разрешения, черно-белой камерой высокого разрешения, управляемым компьютером генератором стимулов и микроманипулятором. Весь аппарат установлен на активном виброизоляционном столе и окружен тяжелыми акустическими шторами и крышей из майлара для минимизации передаваемой по воздуху вибрации. Хотя сбор изображений с обеих камер может выполняться с помощью одного компьютера под управлением NeuroPlex и Global Lab Image 2 или любого другого программного обеспечения для захвата изображений, в данной установке для начала оптических экспериментов используются два компьютера, каждый из которых управляет отдельной камерой.
Поместите камеру с окрашенным препаратом на предметный столик микроскопа. Поскольку D four A и EPPD HQ представляют собой мембранно-нестабильный краситель, который флуоресцирует только в липидной среде, здоровые нейроны окрашенного препарата кишечника при любом увеличении более 20 x должны выглядеть как пустые баллоны. Используйте фильтры HQ 5 35 50 для возбуждения, HQ 5 72 LP для эмиссии и дихроичное зеркало 5 65 nanometer.
Затем с помощью органов управления микроманипулятора установите многоканальный линейный матричный электрод на оральном конце ткани, убедившись, что электрод не касается объектива микроскопа. Линейная матрица, содержащая 10 вольфрамовых электродов, распределенных на отрезке в один сантиметр, позволяет возбуждать несколько независимых нейронных путей и хорошо подходит для изучения взаимосвязанных ганглионарных цепей. Однако для получения репрезентативных данных мы использовали самодельный стимулирующий электрод с двумя выводами.
Используйте липкий воск, чтобы закрепить заземляющий электрод на противоположном конце камеры. Перед началом функциональной записи получите черно-белое изображение высокого разрешения области, из которой будет регистрироваться электрическая активность, для облегчения визуализации. Шкала серого может быть инвертирована, чтобы флуоресценция выглядела темной. Для подачи тока стимуляции с помощью управляемого компьютером генератора стимулов сначала запрограммируйте устройство, выбрав соответствующую интенсивность, длительность, частоту и количество стимулов, а также задержку относительно начала сбора оптических данных.
Чтобы стимуляция происходила в пределах окна сбора оптических данных, настройте генератор стимулов как устройство, управляемое через NeuroPlex. Затем установите в NeuroPlex параметры сбора данных, указав частоту кадров, количество кадров и усиление камеры. Для обеспечения полного разрешения потенциала действия частота кадров должна быть установлена минимум на уровне 1 kHz.
Поскольку D four A и E-P-P-G-H-Q демонстрируют снижение флуоресценции при деполяризации, которое линейно связано с изменением напряжения, инвертируйте отображение оптических сигналов в Neuro Plex, чтобы потенциалы действия не выглядели перевернутыми. Начните регистрацию данных. Не забудьте получить новое черно-белое изображение высокого разрешения для каждого поля зрения перед проведением каждой функциональной записи.
После завершения сбора данных используйте Neuro Plex для анализа результатов в автономном режиме. Область экрана под названием «отображение страницы» показывает исходное изображение препарата, зафиксированное высокоскоростной камерой с разрешением 80 на 80 пикселей, в виде отдельного кадра. При выборе режима страницы «абсолютный кадр» (absolute frame) изображение высокого разрешения, полученное со второй камеры, накладывается на пиксельную карту исходного изображения с помощью команд отображения Neuro Plex.
Для этого необходимо переключить режим страницы с «absolute trace» на «traces» и выбрать наложение изображения (superimposed image) в команде отображения. С помощью мыши выберите отдельные пиксели или группы пикселей на изображении, отображаемом на странице. Данные из этих областей интереса появятся в виде кривых в окне отображения трасс, демонстрируя величину зарегистрированных этими пикселями оптических изменений в зависимости от времени.
Инверсия серой шкалы на изображении высокого разрешения улучшает визуализацию на странице отображения в режиме трассировки; также настоятельно рекомендуется отображать аналоговый выход стимулятора. Выберите канал аналогового выхода для включения в окно отображения трассировки. Этот выход указывает точное время подачи стимулов во время эксперимента.
Чтобы просмотреть данные в виде фильма, используйте команды воспроизведения в программе neuro plex для отображения последовательных кадров набора данных с использованием псевдоцветовых шкал, настроенных по максимальному и минимальному изменению интенсивности флуоресценции. Ганглий из препарата миэнтерического сплетения, окрашенный DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q, был визуализирован с помощью камеры высокого разрешения и объектива 60x. Во время сбора данных препарат стимулировали серией из пяти импульсов с частотой 40 hertz.
При амплитуде каждого импульса 15 мА и длительности 0,5 мс были определены четыре области интереса (ROI), и были построены графики для отображения оптических данных, усредненных по выбранным областям в последовательности псевдоцветных кадров; первые области оптического ответа на деполяризацию мембраны, указывающие на нейронную активность, отображаются в желто-красном цвете. Эти данные свидетельствуют о том, что активность, вызванная стимуляцией, возникает в отдельных областях каждого ганглия и в основном осуществляется проходящими аксонами. ROI 2, 3 и 4 идентифицируют отдельные нейроны на разных расстояниях от ROI 1.
На рисунке 2 при 10-кратном увеличении показаны анатомические пути, по которым может распространяться информация; стрелки указывают направление стимула для активации определенного миентерического ганглия. Мы только что продемонстрировали компоненты оптической установки для регистрации электрической активности с помощью вольт-чувствительных красителей, а также то, как применение этой технологии к интеринервной системе открывает возможность изучения функциональной связности внутри и между двумя интактными сетями млекопитающих непосредственно под микроскопом. При использовании технологии оптической регистрации крайне важно уделять внимание деталям.
Источники оптического, механического и электрического шума должны тщательно контролироваться, а состояние препарата — максимально сохраняться. Таким образом, для успешного проведения оптической регистрации крайне важно в совершенстве овладеть каждым отдельным этапом данного протокола. На этом всё.
Большое спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе показано, как применение вольтаж-чувствительных красителей позволяет осуществлять оптическую запись электрической активности интактных нейронных сетей, таких как сплетения энтерической нервной системы морской свинки, с регулируемым разрешением — от отдельных клеток до многоузловых цепей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Электрофизиология
- Оптическая визуализация
Теоретические основы
- Вольт-чувствительные красители имеют решающее значение для изучения нейронной активности.
- Энтеральная нервная система играет значительную роль в функционировании желудочно-кишечного тракта.
- Методы оптической регистрации позволяют получить представление о нейронных цепях.
- Морские свинки являются широко используемыми моделями для исследований энтеральной системы.
Цель исследования
- Продемонстрировать использование вольтаж-чувствительных красителей при проведении оптической регистрации.
- Исследовать электрическую активность энтеральной нервной системы.
- Предоставить подробный протокол для исследователей.
Используемые методы
- Диссекция кишечника морской свинки для обнажения миenteric-плетения.
- Окрашивание ткани вольт-чувствительным красителем D four A-N-E-P-P-D-H-Q.
- Визуализация окрашенной ткани с высоким разрешением.
- Применение электрической стимуляции во время визуализации для проведения анализа.
Основные результаты
- Успешная оптическая регистрация электрической активности в нейронных сетях.
- Скоростная камера фиксирует динамические изменения в вольт-чувствительном красителе.
- Интеграция изображений высокого разрешения с пиксельными картами для последующего анализа.
- Продемонстрированная эффективность данного протокола для изучения энтеральных нейронов.
Выводы
- Вольт-чувствительные красители эффективны для регистрации нейронной активности.
- Этот метод позволяет углубить понимание функций энтеральной нервной системы.
- Данный протокол может быть адаптирован для различных исследований нейронных сетей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Оптическая регистрация электрической активности в препаратах энтеральной нервной системы с использованием вольтаж-чувствительных красителей представляет собой неинвазивный метод картирования функциональных связей в интактных нейронных сетях. Данный подход способствует валидации мишеней, обеспечивая визуализацию нейронных ответов на фармакологические или электрические воздействия в режиме реального времени, что снижает неопределенность механизмов действия на ранних этапах поиска. Адаптивность метода к различным масштабам увеличения позволяет исследователям в области биофармацевтики переходить от разрешения на уровне отдельных клеток к анализу нейронных цепей на уровне сети, что повышает прогностическую достоверность взаимодействия с мишенью и модуляции сигнальных путей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем корреляции молекулярных событий с электрическим поведением в интактных нейронных сетях.
- Операционная ценность: способствует функциональной валидации мишеней посредством прямого наблюдения за синаптическими взаимодействиями внутри ганглиев и между ними.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в модуляции мишени, раскрывая механизмы распространения электрической активности через взаимосвязанные сплетения.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем сохранения отдельных компонентов рефлекторных путей в полуинтактных препаратах.
- Количественный выход: Получение измеримых изменений флуоресценции, линейно связанных со сдвигами напряжения, что обеспечивает стандартизированное детектирование нейронной активности.
- Масштабируемость: Возможность регулировки пространственного разрешения от субклеточного уровня (~2.5 μm) до мультиганглионарного, что обеспечивает гибкость дизайна анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает актуальность данных от этапа открытия до доклинических стадий за счет сохранения эффекторных систем стенки кишечника, управляемых подслизистым и миenteric сплетениями.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет уточнить вклад конкретных путей в физиологические результаты, снижая риски при выборе мишени.
- Согласованность биомаркеров: Облегчает идентификацию активность-зависимых сигналов, которые могут служить трансляционными биомаркерами функционирования сети.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод встраивается в континуум научных открытий, обеспечивая возможность проверки гипотез на ранних этапах биологических исследований, поддерживая разработку анализа посредством воспроизводимых данных оптического считывания и обосновывая трансляционные решения за счет картирования активности на уровне сетей.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов путем визуализации паттернов электрической активности в ответ на стимуляцию.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу препаратов со стандартизированными протоколами окрашивания и стимуляции для стабильного детектирования нейронной активности.
- Аналитика: предоставляет количественные временные и пространственные показатели оптических изменений, что позволяет сравнивать условия в различных экспериментальных группах.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями за счет сохранения структурной и функциональной целостности нейронных цепей кишечника.
- Корпоративное повторное использование: создает многократную платформу для изучения динамики нейронных сетей для различных классов мишеней и моделей заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозов за счет снижения механистической неопределенности в функционировании нейронных сетей.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированным протоколам инкубации красителя, времени стимуляции и синхронизации изображений.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя прямые доказательства взаимодействия с мишенью в физиологически значимых сетях.
- Влияние на портфель проектов: Позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков, связывая модуляцию мишени с измеримыми изменениями электрической активности сети.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области диссекции тканей, работы с красителями и оптической электрофизиологии.
- Метод зависит от наличия высокоскоростной флуоресцентной микроскопии, компьютеризированных генераторов стимулов и систем виброизоляции.
- Необходима межлабораторная стандартизация протоколов окрашивания, параметров стимуляции и выбора интересующих областей (ROI).
- При переносе протокола на другие типы тканей или модельные организмы следует учитывать необходимость его адаптации.
- Существуют практические ограничения, такие как фототоксичность красителей при высоких концентрациях и необходимость поддержания жизнеспособности тканей при длительной визуализации.
