Генетические исследования белков человека Ремонт ДНК Использование дрожжей в качестве модельной системы

Плазмиды WRN расщепляются с помощью рестриктазы эндонуклеазы 1 и MLU 1, а фрагменты очищаются от геля. Эти векторы экспрессии, расщепленные с помощью фрагментов ONE to MLU one WN, затем лигируются в клетку one to MLU one сайта дрожжевого вектора. Плазмида с несколькими копиями также содержит маркер TRP с одним выбираемым.

Конструкции W Rrn трансформируются в дрожжи в соответствии со стандартными протоколами, а трансформанты подбираются на синтетической полной глюкозной среде, лишенной триптофана. Затем отдельные трансформанты наносятся на синтетическую полную глюкозную среду, лишенную триптофана, и планшеты инкубируются из главной пластины. Для анализа медленного восстановления фенотипа в трансформированных WRN SGS один из трех основных трансформантов двойного мутантного штамма нанесен на пластины, содержащие глюкозу или галактозу.

Для анализа влияния экспрессии WRN на чувствительность HU и MMS проводится пятнистость с целью определения распределения клеточного цикла дрожжевых клеток, экспрессирующих WRN. Выполняется окрашивание DAPI. Экспрессия WRN в гетерологичном хозяине анализируется с помощью западного анализа крови.

Здравствуйте, я Роберт Брох из отдела по случаям ДНК в лаборатории молекулярной геронтологии Национального института старения, одного из институтов Национального института здравоохранения. Здравствуйте, меня зовут Моника Агарвал, я тоже из отдела по случаям ДНК Хели в лаборатории молекулярной генетики Национального института по проблемам старения. Понимание роли белков репарации ДНК человека и генетических путей является доступной задачей для многих исследователей.

Генетические исследования в системах млекопитающих были ограничены из-за отсутствия легкодоступных инструментов, включая мутантные генетические клеточные линии, регуляторные системы экспрессии и соответствующие селективные маркеры. Сегодня мы покажем вам процедуры с использованием дрожжей в качестве модельной системы для исследования молекулярных и клеточных функций фермента, развязывающего ДНК, известного как хеликаза, в предотвращении преждевременного старения. Мы используем эти процедуры в нашей лаборатории, чтобы генетически охарактеризовать роль дефектного продукта гена человека в восстановлении ДНК и поддержании стабильности генома при расстройстве преждевременного старения.

Синдром Вернера Вернера является одним из пяти случаев заболевания человека в семье req на востоке. Существует только один sgs one, изучающий роль человека Вернера в репликационной реакции на стресс. Мы изучили влияние экспрессии Вернера на фоне восточного мутанта на различные биологические конечные точки.

Итак, давайте начнем. Поскольку мы будем использовать дрожжи в качестве гетерологичного хозяина, нашим первым шагом будет клонирование человеческого гена Вернера или его вариации в дрожжевой вектор. Плазмиды Вернера расщепляли с помощью эндонуклеазы Sal one и MLU one и очищали фрагменты внутри, а затем лигировали в один сайт Sal one MLU одного вектора экспрессии дрожжей, который находится под регуляцией галлон-индуцируемого промотора.

Плазмида с несколькими копиями также содержит маркер TRP с одним выбираемым. Эти плазмиды экспрессии Вернера затем трансформируются в соответствующие штаммы триптофана тропных дрожжей, используемые в данном исследовании. А трансформаторы подбирают путем нанесения суспензии на синтетическую полноценную глюкозную среду.

Испытывающие недостаток триптофана инкубируют планшеты при температуре 30 градусов Цельсия в течение трех-четырех дней, пока не появятся колонии. После того, как колонии вырастут, отдельные трансформанты на синтетических полноценных глюкозных средах и инкубируют планшеты при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух-трех дней. Мутантные штаммы ye, экспрессирующие человеческий ген weer и его варианты, затем исследуются на предмет клеточных фенотипов с помощью методов, продемонстрированных в следующих разделах.

У трех ведущих мутантов наблюдается серьезный дефект роста. Тем не менее, мутация в гене SGS one подавляет фенотип медленного роста трех ведущих мутантов для изучения влияния экспрессии Вернера на рост диких штаммов типа S Gs one или S Gs one top three полосы соответствующих штаммов с вектором или плазмидой экспрессии Вернера на синтетические полные медиа-планшеты, лишенные триптофана, но содержащие либо 2% глюкозы, либо 2% лактозы GALA в качестве положительного контроля. Эффект одного сцеживания SGS определяли в инкубационных тарелках при 30 градусах в течение двух суток.

Дикий тип и один мутантный штамм SGS, трансформированный с помощью вектора или Вернера, не показывают никакой разницы в характере роста. Тем не менее, Вернер трансформировал SGS один из трех двойных мутантов значительно медленнее, чем S GS один из трех двойных мутантов трансформирован с помощью вектора для оценки функциональных требований Уорнера для восстановления медленно растущего фенотипа. В первой тройке фоновых штаммов sgs через два дня трансформировались с помощью мутантов каталитического домена Уорнера в синтетические полные планшеты, лишенные триптофана, содержащего либо 2% глюкозы, либо 2% галактозы.

Инкубационный мутант экзонуклеазы Вернера, обозначенный как Е 84 А, восстанавливает фенотип медленного роста, как у Вернера, тем самым показывая, что активность экзонуклеазы не требуется для восстановления трех основных медленно растущих фенотипов. Мутант Вернера Хеликазы хорошо растет, тем самым демонстрируя, что для восстановления трех медленных фенотипов требуется активность Вернера. Определить способность Вернера влиять на скорость роста сгс.

Один из трех лучших штаммов с более низкими уровнями экспрессии белка sgs один из трех лучших штаммов трансформируется с помощью вектора Вернера или sgs один на синтетические полные планшеты, лишенные триптофана, но содержащие возрастающие концентрации галактозы. Инкубируйте все пластины при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух дней. Уорнер и мутант экзонуклеазы Уорнера восстанавливают тройку лидеров с фенотипом на всех уровнях галактозы.

Однако мутанты Warner Helicase этого не делают. Было показано, что двойной мутант SGS one top three менее чувствителен, чем один мутант первой тройки, к алкилирующему агенту ДНК метилметану SULFONATE или MMS или ингибитору репликации гидроксимочевины или HU для определения влияния экспрессии Warner на чувствительность MMS и HE штаммов SGS one или S GS one one top three. Выращивайте штаммы дрожжей, трансформированные с помощью вектора или Вернера, в синтетической полной среде из рафинозы без триптофана при 30 градусах Цельсия в качестве контроля.

Используйте родительский штамм дикого типа, преобразованный с помощью вектора, повторно инокулируйте все культуры в синтетическую полную среду из рафинозы, лишенной тритофана, и выращивайте при температуре 30 градусов Цельсия до ранней фазы логарифма. Когда культуры находятся на ранней стадии логарифма, приготовьте десятикратное серийное разведение, до 10 000 раз этих штаммов, используя синтетические полные среды, лишенные тритофана, выделите четыре микролитра каждого разведения на синтетические полные ГАЛ, лишенные триптофановых планшетов, содержащие 10 миллимолярных HU или 0,0025% MMS, инкубируйте планшеты при 30 градусах Цельсия в течение четырех дней. Двойной мутант SGS one top three, который трансформируется с помощью дикого типа sgs.

Один из них задерживается в поздней SG двух фазах клеточного цикла, что приводит к морфологии гантели. Напротив, дрожжи дикого типа завершают деление клеток, оставляя меньше гантелей для изучения распределения клеточного цикла трансформированного Вернером штамма sgs one top three. Сначала выращивают логарифмически культуры следующих штаммов в синтетических полных средах RAF без триптофана при 30 градусах Цельсия в течение ночи.

SGS один из трех трансформированных вектором Вернера или SGS один и вектор преобразованного родительского штамма Wildtype повторно инокулируют культуры при OD 0,05. После повторной инокуляции растительных культур до наружного диаметра 0,5 и сбора урожая центрифугированием экспрессию Вернера индуцируют добавлением гала-лактозы в концентрации 2%. Дайте культурам расти при температуре 30 градусов Цельсия в течение шести часов.

Через шесть часов соберите культуры, соберите клетки методом центрифугирования. После центрифугирования культуры переложите в микроцентрифужные пробирки, один раз промойте клетки PBS. Затем зафиксировать элементы в 70% этаноле на 20 минут при комнатной температуре, предварительно промыв неподвижные элементы дважды PBS, ресуспендировать элементы в одном XPBS.

Поместите клеточный подвес на предметную горку и добавьте векторный щит. Монтажный материал с DAPI в концентрации один микрограмм на миллилитр. Изучайте предметные стекла под микроскопом XI Saxo vert для поиска клеток с ядрами в форме гантели, что характерно для дрожжевых клеток в SG второй фазе клеточного цикла.

Определить экспрессию белка Вернера или его вариабельность в трансформированных трех основных штаммах дрожжей SGS one или SGS one. Начните с выращивания штаммов в течение шести часов в среде, содержащей галактозу, чтобы вызвать экспрессию белка Вернера. После сбора клеток центрифугированием промойте их PBS и восстановите.

Буфер для щелочного лизиса. Прокипятите клетки в течение пяти минут, затем осветите центрифугированием и нейтрализуйте одним моляром соляной кислоты. Эти лизаты теперь готовы к электрофорезу в 8-16% полиакриламидных гелях SDS для определения уровня экспрессии белка Warner под влиянием различных концентраций галактозы.

Во-первых, индуцируйте культуры с различными концентрациями галактозы в течение шести часов. Затем соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте их в пуховике, содержащем ингибиторы протеазы. Добавьте в смесь стеклянные шарики от 425 до 600 микрон и разбейте ячейки путем вихревого вихря с высокой скоростью в течение минуты с последующей глазурью в течение минуты.

Повторите в общей сложности восемь раз. Далее центрифугируйте полученный гомогенат в течение пяти минут при 15 000 G и соберите надосадочную фракцию. После измерения количества белка в лизатных фракциях по методу Брэдфорда разрешают равные концентрации белка на 8-16% полиакриламидных SDS-гелях Вернера затем определяют по вестерн-блоттингу Вернера в сг.

Первая тройка восстанавливает фенотип медленного роста тройки верхних, как показано на этих фотографиях. Когда sgs один из трех ведущих штаммов трансформируется с помощью вектора Вернера или sgs одну полосу на триптофановой пластине SC, содержащей либо 2% глюкозы, либо 2% галактозы. Индуцированная галактозой экспрессия Вернера приводит к тому, что штамм SGS one one top three растет медленнее.

В противоположность этому, родительский штамм дикого типа или SGS one, трансформированный с помощью Вернера, не подвержен влиянию своего роста, что указывает на то, что медленный рост, придаваемый Вернером, специфичен для sg. Один фон из тройки лучших. Когда SGS один из трех ведущих штаммов, трансформированных с вариантами Вернера, были нанесены на триптофановые планшеты SC, содержащие либо 2% глюкозы, либо только 2% галактозы.

Экзонуклеаза мертвого Вернера все же смогла восстановить фенотип медленного роста. Это демонстрирует, что для восстановления медленного роста фенотипа тройки лидеров требуется геликаза АТФазы Вернера, но не экзонуклеаза. На фоне SGS one top three Вернер восстановил фенотип медленного роста SGS one top three во всем диапазоне концентраций GAL.

Эти результаты указывают на то, что восстановление фенотипа медленного роста в sgs one top three mutant background происходит при низких уровнях экспрессии белка Вернера. При логарифмическом выращивании культур sgs один из трех основных штаммов, трансформированных с помощью Вернера или его вариантов, был обнаружен в десятикратном серийном разведении на тритофановых планшетах SC, содержащих глюкозу или галактозу и либо MMS, либо HU. Мы заметили, что экспрессия Вернера увеличивает MMS и чувствительность в два раза у штамма SGS в первой тройке. Кроме того, это влияние на чувствительность MMS и HU в первой тройке SGS требует геликазы Вернера ATP, но не активности экзона.

Наконец, экспрессия Вернера также восстанавливает характерную задержку SG two из трех верхних, на что указывает повышенная популяция крупных баттированных клеток. В sgs одна из трех верхних мутантных клеток, экспрессирующих Werner. По сравнению с sgs, одну из трех верхних клеток, трансформированных с помощью векторных клеток, окрашивали Dabi.

Для визуализации ядер стрелками указываются неразделенные ядра выражения Вернера. В трансформированных sgs одну из трех верхних клеток индуцировали добавлением указанных концентраций галактозы, и клетки собирали через шесть часов после индукции. Равное количество общего клеточного лизата было загружено в 8-16% полиакриламидных гелей SDS с последующим обнаружением западной крови с использованием антител Уорнера.

Мы показали вам, как исследовать клеточные фенотипы, связанные с определенными мутантными фонами дрожжей, чтобы прояснить клеточные и молекулярные функции гена ученика человека, опосредованные его каталитической активностью и белковыми взаимодействиями. Дрожжи могут быть использованы в качестве модельного организма для изучения функций гена в определенных путях. При выполнении этих процедур важно выбрать подходящий мутантный фон дрожжей, чтобы различить роль исследуемого гена в определенных путях.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.