Генетические исследования белков человека Ремонт ДНК Использование дрожжей в качестве модельной системы

Плазмиды WRN расщепляют рестрикционными эндонуклеазами Cel I и Mlu I, после чего фрагменты очищают из геля. Полученные фрагменты WRN, вырезанные по сайтам Cel I и Mlu I, затем лигируют в сайты Cel I и Mlu I дрожжевого вектора. Многокопийная плазмида также содержит селективный маркер TRP1.

Конструкты W Rrn трансформируют в дрожжи согласно стандартным протоколам, после чего трансформанты отбирают на синтетической полной глюкозной среде без триптофана. Затем отдельные трансформанты с мастер-пластины высевают штрихом на синтетическую полную глюкозную среду без триптофана и инкубируют пластины. Для анализа восстановления фенотипа замедленного роста три лучших трансформанта штамма двойного мутанта SGS one, трансформированного WRN, высевают штрихом на пластины, содержащие глюкозу или галактозу.

Для анализа влияния экспрессии WRN на чувствительность к HU и MMS проводят споттинг с целью определения распределения клеток дрожжей, экспрессирующих WRN, по фазам клеточного цикла. Выполняют окрашивание DAPI. Экспрессию WRN в гетерологичном хосте анализируют с помощью вестерн-блоттинга.

Здравствуйте, я Роберт Брох из отдела ДНК-хеликаз лаборатории молекулярной геронтологии Национального института старения, одного из институтов Национальных институтов здравоохранения. Здравствуйте, я Моника Агарвал, также из отдела ДНК-хеликаз лаборатории молекулярной геронтологии Национального института старения. Понимание роли белков репарации ДНК человека и генетических путей является серьезной задачей для многих исследователей.

Генетические исследования систем млекопитающих были ограничены из-за отсутствия общедоступных инструментов, включая мутантные генетические клеточные линии, регуляторные системы экспрессии и подходящие селективные маркеры. Сегодня мы продемонстрируем процедуры с использованием дрожжей в качестве модельной системы для изучения молекулярных и клеточных функций фермента разматывания ДНК, известного как хеликаза, в предотвращении преждевременного старения. Мы используем эти процедуры в нашей лаборатории для генетической характеристики роли продукта гена человека burner, дефект которого в репарации ДНК и поддержании геномной стабильности приводит к развитию расстройства преждевременного старения.

Синдром Вернера. Белок Вернера является одним из пяти представителей семейства RecQ у человека. Существует только одна именованная модель sgs1 для изучения роли человеческого белка Вернера в ответе на репликативный стресс. Мы исследовали влияние экспрессии белка Вернера на различных биологических конечных точках на фоне мутаций в дрожжах.

Итак, приступим. Поскольку в качестве гетерологичного хозяина мы будем использовать дрожжи, первым этапом будет клонирование человеческого гена Вернера или его варианта в дрожжевой вектор. Плазмиды Вернера были переварили рестрикционными эндонуклеазами Sal I и Mlu I, после чего очищенные фрагменты были лигированы в сайты Sal I и Mlu I дрожжевого экспрессионного вектора, находящегося под контролем галактозо-индуцибельного промотора.

Многокопийная плазмида также содержит селективный маркер TRP1. Эти экспрессионные плазмиды Werner затем трансформируют в соответствующие триптофан-трофные штаммы дрожжей, используемые в данном исследовании. Трансформанты отбирают путем высева суспензии на синтетическую полную глюкозную среду.

В отсутствие триптофана инкубируют чашки при 30 °C в течение трех-четырех дней до появления колоний. После роста колоний отдельные трансформанты пересевают на синтетическую полную глюкозную среду и инкубируют чашки при 30 °C в течение двух-трех дней. Затем мутантные штаммы дрожжей, экспрессирующие человеческий ген weer и его варианты, исследуют на наличие клеточных фенотипов с помощью методов, продемонстрированных в следующих разделах.

Три первых мутанта демонстрируют выраженный дефект роста. Однако мутация в гене SGS1 подавляет фенотип замедленного роста у трех первых мутантов. Чтобы изучить влияние экспрессии Werner на рост штаммов дикого типа, SGS1 или SGS1 top three, высейте соответствующие штаммы с вектором или плазмидой экспрессии Werner на чашки с синтетической полноценной средой, в которой отсутствует триптофан, но содержится либо 2% glucose, либо 2% gala lactose в качестве положительного контроля. Эффект экспрессии SGS1 определяли путем инкубации чашек при 30 °C в течение двух дней.

Штаммы дикого типа и мутантного штамма SGS one, трансформированные вектором или Werner, не демонстрируют никаких различий в характере роста. Однако штамм двойного мутанта SGS one top three, трансформированный Werner, растет значительно медленнее, чем двойной мутант SGS one top three, трансформированный вектором, что позволяет оценить функциональные требования к Werner для восстановления фенотипа замедленного роста. На фоне sgs one top three штаммы sgs one top three, трансформированные мутантами каталитического домена Werner, высевали штрихом на синтетические полноценные среды без триптофана, содержащие либо 2% glucose, либо 2% galactose; результаты оценивали через два дня.

Инкубация мутанта экзонуклеазы Вернера, обозначенного как E 84 A, восстанавливает фенотип медленного роста, подобно Вернеру, что показывает, что экзонуклеазная активность не требуется для восстановления фенотипа медленного роста трех верхних (top three). Мутант хеликазы Вернера растет хорошо, что демонстрирует необходимость хеликазной активности Вернера для восстановления фенотипа медленного роста трех верхних. Чтобы определить способность Вернера влиять на скорость роста sgs.

Один из трех штаммов с низким уровнем экспрессии белка sgs1, трансформированных вектором Werner или sgs1, высевают штрихом на синтетические полноценные среды без триптофана, но с возрастающими концентрациями галактозы. Все чашки инкубируют при 30 °C в течение двух дней. Werner и мутант экзонуклеазы Werner восстанавливают фенотип top3-slope при всех уровнях галактозы.

Однако мутанты по белку хеликазе Вернера этого не проявляют. Было показано, что двойной мутант sgs1 top3 менее чувствителен к алкилирующему агенту ДНК метилметансульфонату (MMS) или ингибитору репликации гидроксимочевине (HU), чем одиночный мутант top3. Для определения влияния экспрессии белка Вернера на чувствительность штаммов sgs1 или sgs1 top3 к MMS и HU, вырастите дрожжевые штаммы, трансформированные вектором или геном Вернера, в синтетической полноценной среде с раффинозой без триптофана при 30 °C в качестве контроля.

Используйте родительский штамм дикого типа, трансформированный вектором; пересейте все культуры в синтетическую полную среду с рафинозой без триптофана и культивируйте при 30 °C до ранней логарифмической фазы. Когда культуры достигнут ранней логарифмической фазы, подготовьте десятикратные серийные разведения данных штаммов вплоть до 10 000-кратного разведения, используя синтетическую полную среду без триптофана. Нанесите по 4 µL каждого разведения на чашки с синтетической полной GAL-средой без триптофана, содержащей 10 mM HU или 0,0025% MMS. Инкубируйте чашки при 30 °C в течение четырех дней. Двойной мутант sgs1 top3, трансформированный sgs дикого типа.

Один из них задерживается в поздней двухфазной стадии SG клеточного цикла, что приводит к морфологии в форме гантели. Напротив, дрожжи дикого типа завершают деление клетки, в результате чего остается меньше клеток гантелевидной формы для изучения распределения клеточного цикла штамма Werner transformed sgs one top three. Сначала overnight вырастите логарифмически растущие культуры следующих штаммов в синтетической полноценной среде RAF без триптофана при 30 °C.

Три наилучших трансформанта SGS1, трансформированных вектором Werner, или SGS1 и трансформированным вектором родительским штаммом дикого типа повторно инокулируют в культуры при OD 0,05. После повторной инокуляции культивируют до OD 0,5 и собирают центрифугированием. Экспрессию Werner затем индуцируют добавлением галактозы в концентрации 2%. Культуры выращивают при температуре 30 °C в течение шести часов.

Через шесть часов соберите культуры, осадите клетки путем центрифугирования. После центрифугирования перенесите культуры в микроцентрифужные пробирки, один раз промойте клетки раствором PBS. Затем зафиксируйте клетки в 70% ethanol в течение 20 минут при комнатной температуре; после этого дважды промойте фиксированные клетки раствором PBS и ресуспендируйте их в одном объеме XPBS.

Поместите суспензию клеток на предметное стекло и добавьте средство для заключения Vector Shield. Используйте среду для заключения с DAPI в концентрации 1 µg/mL. Осмотрите стекла под микроскопом XI Saxo vert, чтобы найти клетки с ядрами в форме гантели, что характерно для дрожжевых клеток в S/G2-фазе клеточного цикла.

Для определения экспрессии белка Вернера или его вариантов в трансформированных штаммах дрожжей SGS one или трех лучших штаммах SGS one сначала культивируйте штаммы в течение шести часов в среде, содержащей галактозу, для индукции экспрессии белка Вернера. После сбора клеток путем центрифугирования промойте их раствором PBS и ресуспендируйте.

Буфер для щелочного лизиса. Кипятите клетки в течение пяти минут, затем осветлите полученный раствор путем центрифугирования и нейтрализуйте его одномолярной соляной кислотой. Полученные лизаты готовы к электрофорезу в 8–16% полиакриламидных SDS-гелях для определения уровня экспрессии белка Warner под влиянием различных концентраций галактозы.

Сначала проведите индукцию культур с использованием различных концентраций галактозы в течение шести часов. Затем соберите клетки путем центрифугирования и ресуспендируйте их в буфере, содержащем ингибиторы протеаз. Добавьте в смесь стеклянные шарики размером от 425 до 600 микрон и разрушьте клетки, подвергнув смесь воздействию вортекса на высокой скорости в течение одной минуты, после чего выдержите на льду одну минуту.

Повторите процедуру в общей сложности восемь раз. Затем центрифугируйте полученный гомогенат в течение пяти минут при 15 000 G и соберите фракцию супернатанта. После определения количества белка во фракциях лизата методом Брэдфорда разделите равные концентрации белка на 8–16% полиакриламидных SDS-гелях; экспрессия Werner затем определяется методом вестерн-блоттинга экспрессии Werner в sgs.

Как показано на этих фотографиях, One top three восстанавливает фенотип медленного роста top three. Штаммы sgs one top three, трансформированные вектором Werner, или sgs one высевают на чашки с средой SC с триптофаном, содержащие либо 2% glucose, либо 2% galactose. Галактоза индуцирует экспрессию Werner, что заставляет штамм SGS one top three расти медленнее.

Напротив, родительский штамм дикого типа или штамм SGS one, трансформированный Werner, не проявляет изменений в росте, что указывает на то, что замедление роста, вызываемое Werner, специфично для фона SGS one top three. Штаммы SGS one top three, трансформированные вариантами Werner, высевали штрихом на чашки с SC-средой без триптофана, содержащие либо только 2% glucose, либо только 2% galactose.

Экзонуклеазно-неактивный Werner все еще был способен восстановить фенотип медленного роста. Это доказывает, что для восстановления фенотипа медленного роста top three требуется АТФазная хеликазная активность Werner, но не экзонуклеазная. На фоне SGS one top three белок Werner восстанавливал фенотип медленного роста SGS one top three во всем диапазоне концентраций GAL.

Эти результаты указывают на то, что восстановление фенотипа медленного роста на фоне мутации sgs1-top3 происходит при низких уровнях экспрессии белка Вернера. Когда логарифмически растущие культуры штаммов sgs1-top3, трансформированные белком Вернера или его вариантами, наносились в десятикратных серийных разведениях на чашки с средой SC-триптофан, содержащей глюкозу или галактозу, а также MMS или HU, мы обнаружили, что экспрессия белка Вернера повышала чувствительность штамма sgs1-top3 к MMS и HU. Кроме того, этот эффект влияния на чувствительность к MMS и HU на фоне sgs1-top3 требует АТФ-зависимой хеликазной активности белка Вернера, но не его экзонуклеазной активности.

Наконец, экспрессия Werner также восстанавливает характерную задержку SG two в клетках top three, о чем свидетельствует увеличение популяции клеток с крупным основанием. В клетках-мутантах sgs one top three экспрессируется Werner. Для сравнения с клетками sgs one top three, клетки, трансформированные вектором, были окрашены Dabi.

Для визуализации ядер; стрелки указывают на экспрессию Werner в неделящихся ядрах. В трансформированных sgs индукция в трех верхних клетках осуществлялась путем добавления указанных концентраций галактозы, сбор клеток проводили через шесть часов после индукции. Равные количества общего клеточного лизата наносили на полиакриламидные SDS-гели с концентрацией 8–16%, после чего проводили вестерн-блот-анализ с использованием антител к Werner.

Мы продемонстрировали вам способ исследования клеточных фенотипов, связанных с определенными мутантными штаммами дрожжей, для выяснения клеточных и молекулярных функций изучаемого человеческого гена, опосредованных его каталитической активностью и белковыми взаимодействиями. Дрожжи могут быть использованы в качестве модельного организма для изучения функций гена в конкретных путях. При выполнении этих процедур важно выбрать подходящий мутантный фон дрожжей, чтобы определить роль исследуемого гена в заданных путях.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.