Денатурирующих Электрофорез Градиент гель (DGGE)

Здравствуйте. Меня зовут Селеста Питерсон, я стипендиат Гарвардского университета, изучаю микробные биопленки. Я провожу профилирование бактериальных сообществ, анализируя последовательности 16S рРНК и то, как эти последовательности меняются во времени и пространстве. Для этого я использую метод DGGE.

Это не обычный акриловый гель для моей лунки; при проведении анализа его необходимо поддерживать при температуре 60 °C, а буфер должен прокачиваться непрерывно. Поэтому мы будем прогревать буфер около часа, пока он не достигнет 60 °C, после чего можно будет запустить процесс. Теперь я промою эту пластину разбавленным раствором uc, удаляя все примеси, и готово, теперь можно включать свет.

Любые подобные факторы могут привести к возникновению артефактов. Важно удалить всю воду. Поэтому при сборке геля я помещу этот чип с внешней стороны геля.

Таким образом, гель будет находиться между этими двумя стеклами, а чип будет расположен снаружи и не повлияет на гель внутри. Теперь я закреплю гель в этих зажимах, затем сожму их и затяну, поворачивая вправо. Как и в случае с любым гелем, важно убедиться, что нижняя часть прилегает плотно.

Чтобы предотвратить утечку, теперь мы переворачиваем гель и помещаем его сюда для герметизации с помощью прокладки. При этом важно, чтобы пластины были точно совмещены с прокладкой. Затем вставляются боковые ручки, и вы нажимаете вниз, чтобы зафиксировать уплотнение.

Перед нами шприц объемом 30 мл. Эти две детали входят в комплект Bio-Rad и устанавливаются следующим образом. Они нужны для удаления излишков воды из трубок.

Установите трубку на гель для его заполнения. Сначала вставьте адаптер в трубку, затем с помощью этого небольшого адаптера введите иглу точно в центр геля так, чтобы она находилась чуть ниже нижнего стекла. Затем этот проволочный адаптер вставляется в длинную трубку, которая будет соединена с двумя шприцами, содержащими растворы высокой и низкой плотности.

Это предварительно приготовленные растворы. В синий я добавил краситель, который указывает на то, что данный раствор является наиболее денатурирующим, а этот — наименее денатурирующим, с низкой плотностью. В них содержится весь необходимый состав.

Теперь я приступлю к приготовлению; фактически, в неделю я делаю это дважды. После достижения нужной температуры у вас есть примерно пять-семь минут, чтобы заполнить гель до того, как начнется полимеризация. Теперь мы наполняем шприц раствором.

Теперь я заполню его примерно 15 мкл раствора. Затем, чтобы удалить пузырьки воздуха, я переверну его вверх дном и аккуратно сожму до тех пор, пока верхний пузырек воздуха не исчезнет. Теперь этот маленький винт вставится в этот паз.

Этот адаптер будет совмещен с данным зажимом и очень плотно зафиксирован с помощью C-образного зажима. Затем эта трубка будет присоединена к шприцу. Аналогичные действия выполняются с другой стороны, с матрицей высокой плотности, где осуществляется подача.

Я буду вращать этот диск плавным движением по часовой стрелке. Сначала выйдет синий раствор, так как он обладает наибольшей плотностью, и он сформирует нижнюю часть геля. Затем, спустя некоторое время, начнет поступать прозрачный раствор, и сформируется градиент.

Наклоните его под небольшим углом. Как только вы закончите заливать гель, немедленно промойте пробирки, так как гель полимеризуется. Теперь эта группа. Затем нажмите. Вот эта часть, и с другой стороны я сделаю то же самое. Хорошо.

Здравствуйте, меня зовут Селеста Петерсон, я научный сотрудник Гарвардского университета, занимаюсь изучением микробных биосообществ. Я провожу профилирование бактериальных сообществ, анализируя последовательности 16S рРНК и то, как эти последовательности меняются со временем и в пространстве. Для этого я использую метод DGGE.

DGE — это денатурирующий гель-электрофорез. Основная идея заключается в наличии градиента: по мере движения по нему ДНК денатурирует. Таким образом, различные виды 16-мерных последовательностей будут останавливаться в разных точках вдоль градиента.

Таким образом, получается своего рода «отпечаток» различных видов секвои в сообществе. Цель моего эксперимента — определить, какие виды присутствуют в сообществе и как их состав меняется во времени и пространстве. Я могу провести гель-электрофорез с использованием маркеров секвои DDD, а затем вырезать полосы и идентифицировать виды, представленные в каждом сообществе.

Одной из главных проблем при проведении гель-электрофореза в градиенте денатуратора (DDG) является подбор оптимального градиента. Этот параметр требует экспериментального определения для каждого конкретного сообщества, чтобы выяснить, какой тип градиента подходит лучше всего. В сегодняшнем эксперименте я использую градиент мочевины от 35 до 55% urea.

Одной из основных проблем, возникающих при использовании данной методики, является появление шлейфов в полосах. Я обнаружил, что в таких случаях одним из наиболее эффективных решений является увеличение времени электрофореза гелей, после чего шлейфы исчезают. Сегодня я применяю этот метод для анализа общих бактериальных сообществ, однако его также можно использовать для изучения конкретного семейства бактерий, чтобы проследить изменения в них с течением времени; в таких случаях гели обычно получаются очень чистыми.

С помощью DDGE также можно исследовать мутации в отдельных генах.