Измерение наведенного напряжения Мембрана с Ди-8-ANEPPS

Для биолога клетка является структурной единицей жизни, содержащей множество различных органелл, каждая из которых выполняет свои специфические задачи, что в совокупности позволяет клетке осуществлять свои жизненно важные функции. С точки зрения электрофизики внутреннее строение не имеет большого значения, и клетку можно рассматривать как проводящую цитоплазму, заключенную в изолирующую мембрану и окруженную проводящей внешней средой. Небольшой дисбаланс концентраций ионов, при котором избыток ионов накапливается у мембраны, приводит к возникновению потенциала покоя мембраны.

Помещение клетки в электрическое поле вызывает локальное перераспределение заряда по обеим сторонам мембраны. Результатом является наведенное мембранное напряжение, которое суммируется с напряжением покоя и исчезает после выключения поля. Для простых форм клеток наведенное мембранное напряжение может быть рассчитано аналитически для сферической клетки.

Это описывается уравнением Швана, согласно которому напряжение пропорционально напряженности поля и размеру клетки, а также изменяется по косинусоидальной функции вдоль мембраны. Для клеток более сложной формы индуцированное напряжение может значительно отклоняться от косинусоидальной функции, и его необходимо определять либо численно с помощью мощного компьютера, либо экспериментально с использованием потенциал-чувствительного красителя. Одним из потенциал-чувствительных красителей, широко используемых для этой цели, является DiBAC₄(3).

Быстрый краситель с спектрами возбуждения и эмиссии, зависящими от потенциала мембраны, AIPs становится интенсивно флуоресцентным при связывании с мембраной, при этом изменение интенсивности флуоресценции пропорционально изменению мембранного потенциала. В данном видео представлен протокол измерения индуцированного мембранного потенциала с использованием D AIPs. В этом примере используются клетки яичника китайского хомячка, которые высевают в камеры из расчета 100 000 клеток на камеру.

В культуре HAMF 12 в среде с добавлением сыворотки плода теленка, L-глутамина и антибиотиков инкубируйте клетки в культуральной среде от двух до четырех часов для получения прикрепившихся клеток сферической формы или от 16 до 20 часов для получения одиночных прикрепившихся клеток более сложных форм. Приготовьте стоковый раствор DiAAPS в концентрации 10 мМ, растворив краситель в DMSO в исходном флаконе. Некоторые клеточные линии могут потребовать дополнительного добавления Pluronic для облегчения встраивания красителя в мембрану. Перенесите один миллилитр модифицированной минимальной’ среды (SMEM) в пробирку Eppendorf, добавив 2,5 мкл 20% Pluronic и три мкл 10 мМ DiAAPS.

В результате получается загрузочный раствор, содержащий приблизительно 30 мкМ diet aaps и 0,05% onic. Замените культуральную среду в камере загрузочным раствором. Перенесите камеру в холодильник на 10 минут при температуре 4 °C.

Поскольку интернализация красителя через плазматическую мембрану после окрашивания в значительной степени подавлена, осторожно промойте образец несколько раз чистым SMEM. В конечном итоге оставьте в камере 1,5 milliliters SMEM. Клетки наблюдают с помощью флуоресцентного микроскопа с масляным иммерсионным объективом, монохроматором и CCD-камерой.

В программном обеспечении для сбора данных установите длину волны возбуждения 419 nanometers и выберите полосовой фильтр, настроенный примерно на 605 nanometers, хотя в данном случае он не применяется. Diet aaps также позволяет проводить рациометрические измерения мембранного напряжения. Поместите камеру с клетками на предметный столик микроскопа, расположите электроды в нижней части камеры и подключите их к генератору импульсов.

В данном примере генерируется прямоугольный импульс с амплитудой 35 вольт и длительностью 50 миллисекунд. С помощью источника постоянного тока и переключателя под управлением микропроцессора импульс подается на пару электродов, что создает между ними электрическое поле и индуцирует мембранный потенциал. Подача импульса должна быть синхронизирована с регистрацией изображения.

Найдите интересующие клетки, примените один электрический импульс или последовательность импульсов. Снимите два флуоресцентных изображения: контрольное изображение непосредственно перед импульсом и изображение импульса во время его подачи, ввиду слабого отклика красителя. Изменения флуоресценции трудно различимы и становятся заметными только после обработки открытых изображений для каждого импульса.

Вычтите фон как в контрольном изображении, так и в изображении после импульса. Выберите клетку и установите область интереса так, чтобы она соответствовала мембране. Измерьте флуоресценцию в этой области на контрольном и импульсном изображениях и перенесите полученные значения в таблицу для каждого импульса.

Вычтите контрольные данные из данных импульса и разделите результат на контрольные данные, чтобы получить относительные изменения флуоресценции. Если применяется серия импульсов, значения относительных изменений, определенные для каждого импульса, можно усреднить. Для получения более достоверного измерения преобразуйте относительные изменения флуоресценции в индуцированное мембранное напряжение.

При использовании калибровочной кривой ее приблизительную оценку можно получить из литературы, однако для повышения точности ее необходимо измерять для каждой конкретной установки. Постройте график зависимости напряжения от относительной длины дуги. Кривую также можно сгладить, используя подходящий фильтр для сферических ячеек.

Полученный график близок к косинусоиде, что согласуется с уравнением Швана. Для более сложных форм клеток та же процедура дает более замысловатые пространственные распределения мембранного потенциала.