Измерение плазматической мембраны Белки Endocytic Цены на Реверсивные биотинилирование

В данном протоколе представлен общий метод измерения скорости эндоцитоза большинства белков плазматической мембраны с использованием восстанавливаемых реагентов для мембранной пермеабилизации. В этой процедуре белки клеточной поверхности, содержащие внеклеточные лизины или ковалентно меченные при температуре 4 °C с помощью sulfo-NHS-SS-biotin (показан здесь зеленым цветом), подвергаются воздействию реагентов. Затем клетки нагревают до 37 °C для инициации эндоцитоза поверхностных белков. После этого клетки снова охлаждают до 4 °C, чтобы остановить мембранный транспорт, и удаляют остаточный биотин с поверхности с помощью восстановителя, который разрывает дисульфидную связь.

Таким образом, единственными оставшимися биотинилированными белками будут те, которые изначально находились на поверхности клетки, были интернализованы и защищены от процедуры удаления биотина. Наконец, клетки подвергают сольватации, а биотинилированные белки выделяют с помощью стрептавидина и аффинной хроматографии. Здравствуйте, я Люк Габриэль из лаборатории Хели Милк Иан в отделении психиатрии Медицинской школы Массачусетского университета.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру измерения скорости эндоцитоза или интернализации с помощью метода обратимого элюирования биотина. Мы используем эту процедуру для измерения скорости интернализации транспортера дофамина. Итак, приступим.

За один день до начала эксперимента подготовьте клетки и субстраты для использования на следующий день. Типы клеток и среды могут различаться, но если используемые в эксперименте клетки обладают низкой адгезией, используйте подходящий субстрат для адгезии клеток, например, планшеты для культивирования тканей с полилизиновым покрытием на шесть лунок. С помощью двух отдельных планшетов промаркируйте в общей сложности четыре лунки.

Для каждого исследуемого белка на контрольной планшете будут использоваться две лунки для контроля общего поверхностного белка и контроля стриппинга. Подготовьте лунку на экспериментальном планшете для каждого тестируемого условия интернализации. Высейте 1 × 10⁶ клеток в 2 мл культуральной среды таким образом, чтобы к следующему дню клетки достигли примерно 80% конфлюэнтности.

После культивирования клеток приготовьте следующие растворы и храните их при температуре four degrees Celsius для использования на второй день. Раствор PBS 2+ готовят на основе фосфатно-солевого буфера с pH 7.4, добавляя в него 1.5 millimolar хлорида магния и 0.2 millimolar хлорида кальция. Раствор для гашения тонации готовят, используя PBS 2+ с добавлением 100 millimolar глицина. Буфер NT состоит из 150 millimolar хлорида натрия, 1 millimolar EDTA, 0.2% BSA и 20 millimolar Трис при pH 8.6. Буфер Рипа готовится с использованием 10 millimolar Трис при pH 7.4, 150 millimolar хлорида натрия, 1 millimolar EDTA, 0.1% SDS, 1% Triton X-100 и 0.1% дезоксихолата натрия.

Затем приготовьте стоковый раствор SULF N-H-S-S-S biotin, растворив его в SULFOXIDE или DMSO до концентрации 200 mg/mL. Разлейте раствор по аликвотам объемом 500 µL и храните при температуре -20 °C. После этого аликвоты могут выдерживать несколько циклов замораживания-оттаивания.

Стоковый раствор дикарбоксиэтилфосфина гидрохлорида (TCEP) готовят в концентрации 500 мМ в 50 мМ Трис-буфере, доводя pH до 7,4. Поскольку TCEP обладает высокой кислотностью, pH раствора необходимо будет скорректировать до 7,4; после чего флакон с TCEP закрывают фольгой и хранят при температуре -20 °C. На второй день готовят раствор PBS 2+ с добавлением 0,18% глюкозы и 0,2% IgG-протеаза-бессывороточного бычьего сывороточного альбумина или PBS 2+ GBSA, который затем предварительно нагревают до 37 °C на водяной бане.

Разморозьте стоковый раствор SFO N-H-S-S-S биотина при комнатной температуре. Непосредственно перед использованием приготовьте свежий раствор серосодержащего N-H-S-S-S биотина. Интенсивно перемешайте раствор на вортексе для полного растворения DMSO.

Поместите обе планшетки на ледяную баню в холодную комнату и трижды промойте каждую лунку двумя миллилитрами ледяного PBS 2+, удерживая планшетки под небольшим наклоном для полного слива буфера. После последнего промывания добавьте в каждую лунку по 0,75 миллилитра свежего раствора сульфо-NHS-биотинового реагента. Инкубируйте в течение 15 минут при температуре 4 °C на ледяной бане, обеспечив интенсивное перемешивание на платформенном шейкере непосредственно перед окончанием инкубации.

Приготовьте еще одну порцию свежего раствора биотина SUHO N-H-S-S-S и через 15 минут замените старый раствор свежим. После второго этапа инкубации выдержите образец еще в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия, подвергая его интенсивному перемешиванию на платформенном шейкере, затем трижды быстро промойте клетки двумя миллилитрами гасящего раствора, чтобы инактивировать все не вступившие в реакцию молекулы NHS-биотина. После этого инкубируйте в двух миллилитрах гасящего раствора в течение 15 минут.

Замените раствор для гашения на свежий через 15 минут и инкубируйте еще 15 минут. Во время каждой инкубации держите планшеты при температуре четыре градуса Цельсия, обеспечивая осторожное перемешивание на платформенном шейкере, в то время как контрольный планшет остается в растворе для гашения на лабораторном столе в холодильной комнате. На данном этапе извлеките экспериментальный планшет из холодильной комнаты, поместив его в ледяную баню.

Если проводится тестирование лекарственных препаратов, добавьте соответствующие концентрации препаратов в предварительно нагретый PBS two с GBSA. В данном случае мы используем либо этанольный носитель, либо 1 µM PMA (палмитоилмиристоилфоросфор триэтилового эфира) для активации пути PKC. Промойте каждую лунку экспериментального планшета трижды, используя по 2 мл предварительно нагретого PBS two с GBSA, добавив соответствующие лекарственные препараты после последнего промывания.

Добавьте по 2 мл соответствующих растворов PBS 2 с GBSA и заполните все пустые лунки предварительно прогретой средой для обеспечения равномерной температуры по всему планшету. Непосредственно перед окончанием инкубации перенесите клетки в инкубатор при 37 °C на 10 минут. Приготовьте свежий стриппинг-раствор, используя 50 мМ раствор TCEP в буфере NT, и храните его на льду.

Приготовьте количество реагента из расчета один миллилитр на лунку. После 10 минутной инкубации быстро перенесите экспериментальный планшет в ледяную баню, а затем верните в холодную комнату. Быстро промойте экспериментальные лунки три раза, используя по два миллилитра ледяного буфера NT на лунку, чтобы остановить эндоцитоз.

Затем трижды промойте лунку контроля смыва двумя миллилитрами ледяного буфера NT. Оставьте лунки общего контроля в затухающем растворе. Добавьте по одному миллилитру раствора для смыва в каждую экспериментальную лунку и лунку контроля смыва, после чего инкубируйте на льду в течение 15 минут.

Четыре градуса Цельсия при осторожном встряхивании до окончания инкубации. Снова приготовьте такой же объем свежего раствора для стриппинга, как и в предыдущий раз. Через 15 минут замените старый раствор для стриппинга свежим и инкубируйте еще 15 минут при четырех градусах Цельсия с осторожным встряхиванием, чтобы сначала лизировать клетки.

Трижды промойте все лунки, в которых использовался раствор для элюции (stripping solution), двумя миллилитрами NT-буфера. Затем трижды промойте все лунки, включая общие контрольные образцы, двумя миллилитрами холодного pbs. После последнего промывания добавьте по 300 µL RIPPA-буфера, содержащего свежие ингибиторы протеаз, в каждую лунку; лизируйте клетки путем встряхивания в течение 20 минут при температуре 4 °C.

Перенесите лизат в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и удалите клеточный дебрис путем центрифугирования в течение 10 минут при 18 000 g и 4 °C. Для определения концентрации белка в лизате по сравнению со стандартной кривой бычьего сывороточного альбумина используйте метод определения белка, совместимый с вашими условиями лизиса, например, BCA-анализ от Pierce. После этого подготовьте лизаты для стрептавидин-аффинной хроматографии.

Наполните микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл эквивалентным количеством белка из каждого образца. В данном эксперименте мы выделяем биотинилированные белки из 50 µg клеточных лизатов. Добавьте буфер RIPA, содержащий ингибиторы протеаз, до конечного объема 200 µl для каждого образца.

Затем тщательно перемешайте на вортексе стрептавидин и агробиды перед использованием; с помощью 200-микролитрового дозатора с обрезанным наконечником перенесите по 20 µL стрептавидина и бидов в каждую пробирку. Перемешайте содержимое пробирок на вортексе и инкубируйте в течение ночи при 4 °C на ротаторе для пробирок. Соберите биды, центрифугируя образцы при 18,000 ×g в течение двух минут при комнатной температуре, аспирируйте лизат, стараясь не приближать аспиратор к осадку бидов, и добавьте 0,75 mL раствора комнатной температуры.

Добавьте буфер для лизиса в каждую пробирку и перемешайте на вортексе на максимальной скорости, чтобы промыть гранулы. Центрифугируйте при 18 000 GS в течение двух минут. При комнатной температуре осадите гранулы и повторите этот цикл «вортексирование — центрифугирование» еще два раза, чтобы в общей сложности провести три промывки после финальной промывки.

Аспирируйте максимально возможное количество буфера, стараясь не задеть осадок из магнитных частиц. Затем добавьте в каждую пробирку от 20 до 25 µL двухкратного восстанавливающего буфера Ламмели. Восстанавливающий агент разорвет биотинилированную дисульфидную связь N-H-S-S-S, высвобождая изолированные белки в раствор.

Поскольку большинство мембранных белков не переносят кипячения, после восстановления и денатурации инкубируйте пробирки на ротаторе в течение 30 минут при комнатной температуре для разделения белков. Используя стандартный SDS-PAGE, перенесите белки на мембрану для иммуноблоттинга и проведите блоттинг с соответствующими антителами. В данном эксперименте мы используем антитела к DAT крысы от Checon, номер 360 9, в разведении 1:2000. Зафиксируйте иммунореактивные полосы с помощью системы гель-документации с CCD-камерой, убедившись в отсутствии насыщенных пикселей. В этом эксперименте мы используем систему визуализации BioRad VersaDoc с программным обеспечением Quantity One для количественного определения плотности каждой полосы.

Здесь представлен репрезентативный иммуноблот, полученный в результате процедуры обратимой модификации транспортера дофамина. Самый сильный сигнал соответствует общему количеству поверхностного белка до интернализации, что видно в дорожке «total» или T. Контроль стриппинга или S в идеале должен быть близок к пустому фону и демонстрировать высокую эффективность стриппинга. Эффективность стриппинга рассчитывается по измерениям плотности полос с использованием следующей формулы.

В данном эксперименте эффективность этой полоски составила 99.8%. Полоски с эффективностью ≥ 90% считаются оптимальными, а результаты ниже этого уровня следует отбраковать. На данном примере полоски с порами видна четкая полоса в дорожке при эффективности полоски 34%. Полосы меньшей интенсивности представляют собой дорожки интернализации с экспериментального планшета. Клетки обрабатывали либо раствором-носителем, либо PMA в концентрации 1 µM в течение 10 минут интернализации, после чего измеряли скорость интернализации транспортера дофамина.

Скорость интернализации рассчитывается на основе измерений плотности полос следующим образом: как видно на этом графике, при воздействии плацебо за 10 минут интернализировалось 10,4% поверхностного DAT. Однако обработка PMA увеличила скорость интернализации DAT до 23,2% от общего количества поверхностного DAT. Таким образом, вы только что увидели, как измерять скорость интернализации белков плазматической мембраны с помощью метода обратимой биотинилизации.

Важно помнить о двух вещах: реагент для биотонилирования, так же как и TCP, необходимо готовить непосредственно перед использованием. Если вы заметили значительную потерю клеток в ходе выполнения протокола, используйте на планшетах субстрат для адгезии клеток. На этом все.

Спасибо за просмотр и удачи в проведении вашего эксперимента.