Флуоресценция Активированный сортировки клеток растений Протопласты

Метод выделения специфические типы клеток из растительного сырья демонстрируется. Эта техника работает трансгенных линий маркера выражения флуоресцентных белков, в частности, типы клеток, клеточной диссоциации и флуоресценции Активированный сортировки клеток. Кроме того, рост установки устанавливается здесь, что облегчает лечение

Эта процедура основана на растениях, экспрессирующих GFP в определенных типах клеток, которые затем могут быть выделены из остальных растительных клеток с помощью сортировки клеток, активированных флуоресценцией, или фактов. В этом примере используются две маркерные линии, экспрессирующие определенные типы клеток Arabidopsis. Рассаду корня алианы выращивают в фитолотках или на агаровых пластинах.

Их корни собирают и обрабатывают ферментами, расщепляющими клеточную стенку. Через час раствор процеживают, чтобы удалить крупный мусор. Затем раствор центрифугируют, а надосадочную жидкость удаляют.

Положительные протопласты GFP впоследствии разделяются по факсу. Отсортированный материал может быть использован для анализа специфичных типов клеток, таких как полногеномные транскрипционные профили. Привет, я Басиан Бармен из лаборатории Кена Бирнбаума на биологическом факультете Нью-Йоркского университета.

Сегодня мы покажем вам процедуру сортировки флуоресцентно-активированных клеток растительных протопластов. В этом примере мы будем сортировать два конкретных типа клеток в пути Arabidopsis. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения транскрипционных профилей конкретных типов клеток.

Итак, приступим. Чтобы начать эту процедуру, выращивайте рассаду дикого типа, а также рассаду, которая имеет специфическую для типа клеток экспрессию GFP. Промотор пугала, управляющий GFP, отмечает эндодерму корня и центр покоя в одной группе сеянцев.

А в другой группе корневой спокойный центр отмечен прогулками пятерки промоутера за рулем GFP. Рассада выращивается на гидропонике и в лотках FIA поверх нейлонового фильтра, который позволяет корням прорастать в питательную среду. В качестве альтернативы растения можно выращивать на вершине капроновой сетки и вертикально расположенных пластинах 1%-го агара.

Помимо помощи в сборе корней, фильтры позволяют массово пересаживать рассаду в новые фитолотки или агаровые пластины, где она может быть дополнена интересующим их катализатором. Это может быть сделано для изучения транскрипционных реакций конкретных типов клеток на питательные вещества, гормоны или лечение стресса. Проверьте под флуоресцентным микроскопом, чтобы убедиться, что флуоресцентный маркер экспрессируется должным образом.

Убедитесь, что характер экспрессии маркера постоянен в применяемых условиях лечения, так как он может измениться в результате лечения. Приступайте к сбору урожая и подготовке протопластов. Начните с приготовления раствора протопластов.

Смешайте 1,25% веса на объем, целлюлазу, 0,3% веса на объем, мазер зим, 0,4 моляра D, маннитол 20 ммоль, MES и 20 ммилляр KCL в деминерализованной воде и отрегулируйте pH до 5,7 с одним моляром tris HCL при pH 7,5. Такой раствор будет слегка мутным. Затем нагрейте раствор до 55 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Раствор станет прозрачным, даст ему остыть до комнатной температуры, а затем добавит 0,1% веса на объем BSA 10 миллимолярного хлорида кальция и пять миллимолярных бета-ме капто-этанола урожая недельного урожая рассады из одного фитолотка. В случае с пугалом линейкой GFP или восемью пластинами четырехдневной давности выгуливает 5G FP рассаду. Соскребите корни с капроновой сетки с помощью скальпеля, затем положите их в емкость с раствором протопластов.

Используйте примерно 10 миллилитров раствора протопластов на 1500 рассады. Осторожно встряхивайте колбы при 75 об/мин при комнатной температуре в течение часа. Более длительное время инкубации может увеличить выход протопластов, но также усилит влияние самих протопластов на экспрессию генов.

Теперь, когда протопласты высвобождены, используйте клеточный фильтр 40 микрометров, чтобы отфильтровать раствор и разделить суспензию протопластов между коническими трубками диаметром 15 мил. Важно получить чистую суспензию протопластов без слишком большого количества мусора, чтобы предотвратить засорение фактов и свести к минимуму время, необходимое для сортировки клеток. Центрифугируйте пробирки в центрифуге с качающимся ведром при температуре 500 G в течение 10 минут при комнатной температуре.

Обратите внимание, что скорость центрифугирования зависит от строения участка растения, дающего протопласты, и количества клеточного мусора, образующегося при ферментативной обработке. После центрифугирования удалить большую часть надосадочной жидкости и аккуратно ресуспендировать гранулу, содержащую протопласты, в небольшом объеме оставшегося раствора протопластов. Наконец, подсчитайте протопласты с помощью гемоцитометра и определите их плотность, чтобы рассчитать выход и принять решение о параметрах прогона по фактам.

После подсчета осмотрите протопласты. Проверьте их целостность, уровень экспрессии GFP и содержание загрязняющего клеточного мусора. Далее перейдите к факсу.

Если нет, переходите непосредственно к факсу. Протопласты можно промывать, ресуспендировать и хранить в инкубационном растворе, таком как раствор для протопокрытия, без добавления ферментов или раствора W five. Включите сортировщик ячеек и рабочую станцию компьютера.

Здесь мы используем фриа производства Becton Dixon and Company. Используйте один XPBS в качестве жидкости оболочки и запустите процедуру жидкостного запуска. Установите сопло 100 микрометра и установите давление оболочки 20 фунтов на квадратный дюйм.

Настройте стабильный поток потока и откалибруйте задержку сброса. Обратите внимание, что калибровка в данной процедуре не отображается. Суспензии протопластов с плотностью до 10 миллионов клеток на милл могут быть успешно отсортированы.

Чтобы предотвратить осаждение протопластов, используйте опцию перемешивания образца на фактах. Если проблема заключается в засорении фактов, есть три возможных шага съемки. Во-первых, выполните промывку образца с обратной линией.

Во-вторых, разбавьте суспензию протопластов, чтобы уменьшить плотность. В-третьих, очистите раствор протопластов путем повторения этапа фильтрации после центрифугирования и реактивной суспензии. Для отличия GFP-положительных протопластов от GFP-отрицательных протопластов и клеточного мусора используются всего четыре параметра: после возбуждения лазером 488 нм прямое рассеяние является показателем размера частиц, боковое рассеяние — показателем зернистости частиц.

Излучение на 530 нм как мера зеленой флуоресценции и излучение на 610 нм как мера автофлуоресценции красного спектра. Начните с настройки точечной диаграммы для прямого и бокового разброса. Установите напряжение так, чтобы измеренные события были центрированы на графике.

GFP-положительные протопласты можно отличить по повышенному соотношению зеленого и красного излучения по сравнению с событиями с автофлуоресценцией. Настройте только точечную диаграмму с зеленой флуоресценцией и автофлуоресценцией красного спектра. Применяйте настройки напряжения таким образом, чтобы измеренные события приводили к образованию одной диагональной популяции на графике.

При рассмотрении суспензии протопластов дикого типа, GFP-положительные протопласты должны производить четкую популяцию зеленых флуоресцентных событий, никогда не наблюдаемых в образцах дикого типа. Установите ограничения компенсации для корректировки спектрального перекрытия между зеленой флуоресценцией и автофлуоресценцией красного спектра. Используя суспензию GFP-положительных ПРОТОПЛАСТОВ, правильные настройки компенсационных ограничений позволят лучше отделить положительные протопласты GFP от протопластов, не входящих в GFP, а мусор создаст затвор для идентификации положительных событий GFP.

Рекомендуется брать с собой ПРОТОПЛАСТЫ, не относящиеся к GFP, каждый раз, когда вы готовите эксперимент по сортировке, чтобы помочь определить границы затворов. Наконец, установите порог прямого рассеяния, чтобы не допустить попадания мелких мусоров в анализ. Визуализация положительных событий GFP на графике прямого рассеяния и бокового рассеяния поможет определить, где следует установить пороговое значение.

Параметры, заданные в этом первоначальном прогоне фактов, могут быть повторно использованы для будущих сортировок. Потребуются небольшие корректировки для повседневного использования фактов. Для извлечения РНК подготовьте пробирки для сбора, содержащие буфер для экстракции РНК, в качестве ориентира используйте не более 100 микролитров сортировочного объема до 350 микролитров экстракционного буфера.

За 20 000 сортировок получается общий объем сортировки около 100 микролитров. Теперь, когда параметры факса и режимы работы установлены, а пробирки для сбора готовы и приступайте к сортировке протопластов, после завершения сортировки приступайте к сортировке. Смешайте пробирки для сбора образцов, так как клеточная суспензия может накапливаться наверху, всего 500 отсортированных событий могут быть использованы для анализа микрочипов после экстракции РНК и амплификации CD NA.

Здесь мы используем набор для микроэкстракции RNEZ, систему амплификации РНК WT ovation PICO и модуль биотина fl ovation CD NA V two. Вот типичные факсимильные результаты для протопластов, полученные из протопластов без GFP Scarecrow, GFP и W 5G FP 100 000 событий представлены на каждой точечной диаграмме зеленой флуоресценции по оси x по сравнению с красной флуоресценцией. На оси Y события, попадающие в сортировочный шлюз GFP, выделены зеленым цветом.

Это краткое изложение типичного выхода протопластов из проростков, экспрессирующих либо GFP пугала, обозначающего эндодерму корня и центр покоя, либо 5G FP, обозначающий центр покоя корня. В центре покоя корня меньше клеток по сравнению с эндодермой корня. Таким образом, несмотря на то, что изначально было больше протопластов, выход клеток, экспрессирующих GFP, меньше в сортировке 5G FP по сравнению с сортировкой GFP пугала, показанной здесь, являются типичными результатами экстракции РНК тройных образцов.

Каждый образец соответствует РНК, выделенной из 10 000 событий. Извлеченная РНК анализируется на биоанализаторе, показывающем рибосомные пики для образцов GFP пугала сверху, а образцы 5G FP ниже экстрагированной РНК могут быть в дальнейшем использованы для анализа микрочипов. Эта точечная диаграмма log two уровней выражения демонстрирует сходство между двумя репликами.

Мы только что показали вам, как выполнить флуоресцентно-активируемую сортировку клеток растительных протопластов для анализа конкретных типов клеток. Этот метод применим ко многим различным тканям и видам растений. Хороший выход с низким содержанием мусора и здоровыми протопластами даст лучшие результаты в транскрипционном и других анализах.

Также помните, что для сравнения отсортированных образцов важно сохранять идентичные условия роста растительного материала. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.