Пресинаптически Тихая Синапсы Учился с световой микроскопии

Некоторые пресинаптические терминали в центральной нервной системе кажутся нефункциональными или «молчащими». В данном протоколе представлен метод идентификации молчащих пресинаптических терминалей. Этот протокол может быть применен для выявления методов лечения и манипуляций, которые, по предположению, приводят к подавлению функции или «пробуждению» терминалей.

Данный протокол сочетает окрашивание синаптических пузырьков витальным красителем во время деполяризации нейронов с последующим мечением фиксированных клеток антителом, которое связывается со всеми пресинаптическими терминалями, как молчащими, так и активными. Синапсы, имеющие двойную метку (красителем и антителом), являются активными. Синапсы, помеченные только антителом, являются молчащими.

Здравствуйте, я Аманда Тейлор из лаборатории доктора Стива Миника на кафедре психиатрии медицинского факультета Вашингтонского университета. Я Шахин, также из лаборатории Маника. Сегодня мы хотели бы продемонстрировать вам процедуру визуализации «молчащих» пресинаптических окончаний с использованием культур нейронов гиппокампа.

В нашей лаборатории мы используем данную процедуру для изучения того, как электрическая активность и другие сигнальные пути модулируют высвобождение нейромедиаторов. Итак, приступим. В стерильном ламинарном шкафу используйте ткани мозга крыс или мышей с 0-го по 3-й день после рождения для подготовки культур диссоциированных клеток.

Согласно нашему опубликованному протоколу, используемые нами смешанные глиальные культуры, полученные из одного и того же материала диссекции, следует высеивать в стерильные чашки диаметром 35 мм. В каждой чашке должно находиться покровное стекло номер 0, покрытое коллагеном в концентрации 5 мг/мл. Нейроны высеивают с приблизительной плотностью 500 клеток на см².

12 крысят обычно позволяют получить 30 чашек диаметром 35 мм. Оставьте культуры расти в инкубаторе для культур от 10 до 14 дней. Для обеспечения развития и созревания синапсов на четвертый день культивирования (in vitro) добавьте антимитотик а-C, чтобы остановить рост глии.

Также на пятый день культивирования in vitro проведите частичную замену среды (на половину объема) на нейробазальную среду с добавлением supplements B 27 для повышения выживаемости нейронов в этот период созревания. Примените воздействия, изменяющие количество пресинаптически молчащих синапсов. Мы обнаружили, что одним из удобных способов перевода значительного процента глутаматергических синапсов в молчащее состояние является четырехчасовая обработка 30 mM калия.

Когда культуры созреют, нейроны должны иметь относительно низкую плотность с хорошо разделенными и протяженными нейритами. Извлеките культуры из инкубатора и перенесите их на рабочий стол. Замените питательную среду на буферный солевой раствор, содержащий 45 millimolar KCl и 10 micromolar красителя FM 1 43 FX.

Этот раствор также должен содержать NBQX и A PV для предотвращения рекуррентной передачи сигналов. Важно хранить стоковый раствор FM 1 43 FX и проводить эксперименты в темноте, чтобы избежать фотовыцветания. Поэтому на всех последующих этапах инкубации накрывайте чашки с культурами фольгой.

Инкубируйте ровно две минуты при комнатной температуре. Удалите раствор красителя и промывайте в течение всего трех-пяти секунд в фосфатно-солевом буферном растворе с 500 мкМ азотид натрия, чтобы удалить неспецифически связавшийся краситель; соблюдение временных интервалов на этом этапе имеет решающее значение.

Поскольку длительное воздействие adv adverse F seven удаляет всю маркировку FM 43 FX, промойте клетки в фосфатно-солевом буфере без adv adverse Seven пять раз с интервалом в две минуты в вытяжном шкафу.

Зафиксируйте культуры в 4% паральдегиде и 0,2% глутаральдегиде в PBS в течение 10 минут. Кратковременно промойте клетки PBS. Теперь образцы с клетками можно вынести из вытяжного шкафа.

Добавьте блокирующий раствор, содержащий 4% нормальной сыворотки козы и 0,04% Triton X, чтобы снизить фоновый сигнал и пермеабилизировать клетки для иммуноокрашивания. Инкубируйте в течение 15 минут. Окрасьте клетки антителами к vlu T one, разведенными в блокирующем растворе в пропорции 1:2000.

Инкубируйте культуры с антителами при осторожном встряхивании в течение трех часов. Промойте клетки четыре раза с помощью PBS. Инкубируйте клетки с Alexa.

6 47 конъюгированное антитело против морской свинки, разведенное в соотношении 1:500 в блокирующем растворе. Выдержите культуры с вторичным антителом при осторожном покачивании в течение 30 минут. Промойте клетки еще четыре раза с помощью PBS.

С помощью пинцета нанесите небольшую каплю суспензии клеток на чистый предметное стекло. Возьмите покровное стекло и аккуратно опустите его на каплю суспензии так, чтобы клетки были обращены к предметному стеклу. Оставьте препарат до высыхания на ночь.

Подготовьте объектив с увеличением 60x и масляным погружением на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе. Поместите предметное стекло на предметный столик так, чтобы покровное стекло было обращено к объективу. Найдите область нейритов, которая не является слишком плотной и находится вдали от сомы, в которой может удерживаться остаточный краситель.

Установите размер поля обзора 51 на 51 микрон. С помощью программного обеспечения для сбора изображений получите Z-стек, охватывающий глубину 7.8 микрон с шагом 0.3 микрон за каждый из 27 шагов.

Сначала проведите сканирование с использованием антител к VGLUT1 для идентификации всех глутаматергических синапсов в поле зрения. Затем повторно отсканируйте область на флуоресценцию FM 1-43 FX для последующего анализа полученных изображений. Используйте программное обеспечение для анализа, чтобы преобразовать Z-стек в композитное изображение одной плоскости на основе максимальной интенсивности сигнала в любой плоскости для каждого пикселя, установив соответствующий порог.

Чтобы снизить уровень фонового шума, идентифицируйте терминали VG glu T one без учета окрашивания красителем FM 1 43. Пометьте эти пункты как области интереса. Обычно мы выбираем по 10 ПУНКТОВ на поле зрения.

Повторите процедуру пороговой обработки и выбора пунктированных структур (пункта) на изображении с эффектами FM 1 43 и наложите изображения друг на друга для идентификации «молчащих» синапсов. Для разграничения активных (положительных по FM 1 43) и неактивных (отрицательных по FM 1 43) синапсов можно использовать абсолютный критерий количества пикселей или процентный критерий. В наших культурах мы обнаружили, что 70–80% глутаматных синапсов, определенных по окрашиванию на V glut one, демонстрируют детектируемое окрашивание FM 1 43 на совмещенных изображениях зеленой флуоресценции FM 1 43 и красного окрашивания V glut one.

Это проявляется в виде обилия желтых пунктат-синапсов с колокализованными маркерами. Они отмечены стрелками. Примерно от 20 до 30% красных V glut one положительных пунктат не будут иметь зеленой флуоресценции FM 1 43 выше фонового уровня.

Это неактивные пресинаптические терминали, пример которой отмечен наконечником стрелки. Также будет наблюдаться третья популяция синапсов. Они обладают положительной зеленой флуоресценцией FM 1 43, но лишены красного окрашивания B glut one.

Это активные ГАМКергические синапсы, один из которых отмечен звездочкой. Они исключены из большинства наших анализов, но их можно детально изучить с помощью антител к везикулярному транспортеру ГАМК. Вместо антитела к VLU T один мы только что продемонстрировали вам способ визуализации пресинаптически молчащих синапсов с использованием FM 1 43 и иммуноокрашивания на VLU один.

При выполнении этой процедуры важно помнить, что FM 1 43 FX чувствителен как к времени пребывания в промывочном растворе adver sub seven, так и к концентрации обрабатывающего X 100, входящего в состав блокирующего раствора. На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.