Пресинаптически Тихая Синапсы Учился с световой микроскопии

Некоторые пресинаптические терминали в центральной нервной системе кажутся нефункциональными или бесшумными. Здесь мы представляем протокол для идентификации тихих пресинаптических терминалов. Этот протокол может быть применен для выявления методов лечения и манипуляций, которые подозреваются в подавлении или пробуждении терминалей.

Протокол сочетает в себе мечение синаптических везикул жизненно важным красителем во время деполяризации нейронов с последующим мечением фиксированных клеток антителом, которое помечает все пресинаптические окончания, как тихие, так и активные. Синапсис. Ко, меченный красителем, и антитела активны. Синапсы, помеченные только антителами, молчат.

Здравствуйте, меня зовут Аманда Тейлор из лаборатории доктора Стива Миника на кафедре психиатрии Медицинской школы Вашингтонского университета. Я Шахин, тоже из Manic Lab. Сегодня мы хотели бы показать вам методику визуализации молчаливых пресинаптических окончаний с помощью культивируемых нейронов гиппокампа.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения того, как электрическая активность и другие одиночные пути нолинга модулируют высвобождение нейротрансмиттеров. Итак, приступим. В стерильном колпаке с ламинарным потоком использовать HIPA нельзя с нулевого до третьего дня после рождения крыс или мышей для приготовления диссоциированных клеточных культур.

Согласно опубликованному нами протоколу, наши культуры являются смешанными глиальными культурами, полученными из одних и тех же диссекционных клеток, которые должны быть помещены в стерильные 35-миллиметровые посуды. Каждый из них содержал нулевую защитную пластину, которая была покрыта пятью миллиграммами на миллилитр коллагеновой пластины. Нейроны имеют приблизительную плотность 500 клеток на квадратный сантиметр.

Из 12 крысят обычно получается 30-35-миллиметровая тарелка. Дайте культурам порасти в инкубаторе для культур от 10 до 14 дней. Для синаптического развития и созревания добавьте антимитотический витамин С, чтобы остановить рост глии в четвертый день in vitro.

Также в пятый день in vitro проведите половинчатый обмен нейробазальной средой плюс добавкой B 27 для повышения выживаемости нейронов в этот период созревания. Вводите методы лечения, которые изменяют количество пресинаптически молчаливых синапсов. Мы обнаружили, что одним из удобных способов подавить большой процент глутаматных синапсов является четырехчасовое лечение 30 миллимолярами калия.

Когда культуры созревают, нейроны должны иметь относительно низкую плотность с хорошо разделенными и обширными невротическими процессами. Извлеките культуры из инкубатора и доведите их до стенда. Замените питательную среду буферизованным солевым раствором, содержащим 45 миллимоляров хлорида калия и 10 микромоляров FM 1 43 FX.

Это решение также должно содержать NBQX и A PV для предотвращения повторной передачи сигналов. Важно, чтобы стоковый раствор FM 1 43 FX и эксперименты хранились в темноте, чтобы предотвратить фотообесцвечивание. Поэтому накрывайте посуду для культуры пленкой для всех последующих этапов инкубации.

Выдерживать ровно две минуты при комнатной температуре. Удалите раствор красителя и простирайтесь всего на три-пять секунд в кучу буферизованным физиологическим раствором с 500 микромолярами противника. Семь. Для удаления неспецифического красителя время на этом этапе имеет решающее значение.

Поскольку длительное воздействие adv неблагоприятно F 7 удалит всю маркировку FM 43 FX. Затем промойте клетки и кучи буферным физиологическим раствором без побочных эффектов. Семь на пять двухминутных интервалов в химическом вытяжном шкафу.

Зафиксируйте культуры в 4% паральдегиде и 0,2% глутаральдегиде в PBS в течение 10 минут. Кратковременно промойте клетки с помощью PBS. Теперь ячейки можно перемещать из вытяжного шкафа.

Добавьте блокирующий раствор, содержащий 4% нормальной козьей сыворотки и 0,04% триттона X, чтобы уменьшить фон и проникнуть в клетки для иммуноокрашивания. Выдерживать в течение 15 минут. Окрашивают клетки одним антителом vlu T, разведенным до одного к 2000 в блокирующем растворе.

Инкубируйте культуры в антителах с легким покачиванием в течение трех часов. Четыре раза промойте клетки PBS. Инкубируйте клетки с помощью Alexa.

6 47 конъюгированные антитела против морской свинки, разведенные до одного к 500 в блокирующем растворе. Сохраняйте культуры во вторичном антителе с помощью легкого покачивания в течение 30 минут. Промойте клетки еще четыре раза с помощью PBS.

Поместите небольшую каплю напольного масла на чистое стеклянное стекло с помощью щипцов. Возьмите в руки чехол и аккуратно опустите его на обрыв пола с количеством ячеек, обращенных к горке. Дайте предметному стеклу высохнуть в течение ночи.

Подготовьте масляный объектив с 60-кратным увеличением на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе. Поместите слайд на сцену так, чтобы защитный лист был обращен к цели. Найдите поле нейритов, которое не было бы слишком плотным и которое было бы удалено от сомы, которая может удерживать остаточный краситель.

Увеличьте масштаб до размера поля 51 на 51 микрон. Использование программного обеспечения для получения изображений. Приобретайте стек ZS глубиной 7,8 микрон на 27 ступенях по 0,3 микрона для каждого шага.

Сначала просканируйте антитело VLU T one, чтобы идентифицировать все глутаматергические синапсы в полевых условиях. Затем выполните повторное сканирование для флуоресценции FM 1 43 FX для анализа изображений после получения. Используйте аналитическое программное обеспечение для преобразования Z-образной привязки в составное изображение в одной плоскости на основе показаний максимальной интенсивности из любой плоскости при каждом заданном пороге пикселя.

Чтобы уменьшить фон, идентифицируйте клеммы VG glu T one без привязки к пятну эффектов FM 1 43. И отметьте эти пункты как области интереса. Обычно мы выбираем 10 PUNTA для каждого поля.

Повторите пороговое и пунктирное выделение на изображении эффектов FM 1 43 и наложите изображения для идентификации тихих синапсов. Абсолютный критерий пикселей или процентный критерий пикселей может быть использован для различения активных позитивных синапсов FM 1 43 и неактивных негативных синапсов FM 1 43. В наших культурах мы обнаружили, что от 70 до 80% глутаматных синапсов, определяемых окрашиванием V glut one, обнаруживают окрашивание FM 1 43 в наложенных изображениях флуоресценции зеленого FM 1 43 и красного окрашивания V glut one .

Это проявляется в обилии желтых точечных синапсов с ко-локализованными маркерами. Они обозначены стрелками. Примерно от 20 до 30% красного V-избытка одной положительной точки не будут иметь зеленого FM 1 43 флуоресценции выше исходного уровня.

Это неактивные пресинаптические терминалы, и пример указан стрелкой. Также будет наблюдаться третья популяция синапсов. Они положительны на флуоресценцию зеленого FM 1 43, но лишены красного B перенасыщения одним цветом.

Это активные ГАМКергические синапсы, и пример обозначен звездочкой. Они исключены из большинства наших анализов, но могут быть специально изучены с использованием везикулярного антитела-транспортера ГАМК. Вместо антитела VLU T one мы только что показали вам, как визуализировать пресинаптически тихие синапсы с помощью иммуноокрашивания FM 1 43 и VLU one.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что FM 1 43 FX чувствителен как ко времени в адвере до семи стирок, так и к концентрации лечебного X 100, входящего в состав блокирующего раствора. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.