Прямое наблюдение Ферменты Репликация ДНК Использование одиночных молекул ДНК Растяжка Пробирной

В этом видео демонстрируется протокол визуализации репликации ДНК с помощью широкопольной оптической микроскопии, линеаризованной и химически модифицированной лямбды. ДНК прикрепляется к функционализированному стеклянному покровному листу. Свободный конец ДНК помечен бусинами, и ДНК растягивается ламинарным потоком.

Когда начинается репликация, ведущая цепь начинает удлиняться, а отстающая цепь укорачивается из-за скручивания. Большая разница в длине между двухцепочечной и одноцепочечной ДНК при малых усилиях позволяет непосредственно наблюдать за конверсиями ДНК во время репликации. Длина конструкции ДНК контролируется путем отслеживания положения бусины, что позволяет точно определить скорость и процесс репликации ДНК.

Здравствуйте, меня зовут Ари Ульрих из Лабораторий Анто и Чарльз Ричардсон с факультета биологической химии и молекулярной фармакологии Гарвардской медицинской школы. Сегодня мы покажем вам процедуру визуализации репликации ДНК на одном молекулярном уровне. Мы используем эту процедуру в наших лабораториях для изучения ферментативной активности, происходящей во время синтеза ДНК.

Итак, приступим к началу этой процедуры. ДНК линеаризованных бактериальных фагов лямбда модифицируется коленопреклоняющимися олигонуклеотидами с образованием репликационной вилки, комплементарного плеча лямбда-вилки, биотинилированного плеча вилки и праймера вилки. Биотинилированное предплечье вилки содержит биотин t, прикрепленный к его пяти основным концам, что позволяет привязывать матрицу ДНК к поверхности проточной ячейки.

ДНК лямбды дополнительно модифицируется путем отжига, другого олигонуклеотида, который содержит дигген и фрагмент, служащий высокоаффинной иммунометкой для прикрепления шарика. Чтобы создать репликационную вилку, получите лямбда-ДНК в дополнение к нескольким олигонуклеотидам, последовательности которых можно найти в письменном протоколе, прилагаемом к этому видео. Эти олигонуклеотиды включают биотинилированное плечо вилки, плечо комплементарной вилки лямбда, праймер вилки и комплементарный дигген и концевой фосфорилат пяти основных концов плеча комплементарной вилки лямбда и конца комплементарного дигогенина лямбда, использующего полинуклеотидкиназу Т-4.

Затем смешайте фосфорилированное лямбда-комплементарное плечо, биотинилированное плечо вилки, праймер вилки и лямбда-ДНК в молярном соотношении от 10 до 10 до 100 к одному. В буфере Т-4 ДНК-лигазы нагрейте смесь при температуре 65 градусов Цельсия в течение пяти минут и медленно охладите до комнатной температуры, выключив нагревательный блок, чтобы обеспечить надлежащий отжиг олигонуклеотидов и Т-четырех ДНК-лигазы в смеси, и инкубируйте в течение двух часов. При комнатной температуре Т-4 ДНК-лигаза будет катализировать герметизацию зазубрин между олигонуклеотидами и лямбдой.

ДНК окончательно анилизуют комплементарный дигген и заканчивают в матрице репликации ДНК путем добавления фосфорилированного комплементарного диггена лямбда-комплементара диггена и заканчивают в буфере Т-4 лигазы, инкубируют смесь в течение 30 минут при 45 градусах Цельсия и снова, медленно охлаждают до комнатной температуры, выключая тепловой блок, лигатируют фосфорилированный комплементарный лямбда-комплементарный кислород и заканчивают в матрице репликации ДНК, добавляя в смесь Т-четыре лигазы ДНК, и Выдерживают в течение двух часов при комнатной температуре. Окончательный шаблон репликации ДНК теперь готов к использованию. Для того чтобы прикрепить активированные кисточкой магнитные шарики к матрице репликации ДНК, они должны быть функционализированы фрагментом FAB, специфичным для дигогенина.

Чтобы начать этот процесс, суспендируйте стоковый раствор бусин и переложите 400 микролитров в трубку эйнора. Поместите пробирку в магнитный сепаратор и инкубируйте до тех пор, пока раствор не исчезнет. Затем удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования Чтобы активировать тоальные группы для связывания антител, добавьте один миллилитр буфера boid и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования.

Снова удалите надосадочную жидкость с помощью магнитного сепаратора. Далее добавьте 240 микролитров фрагмента FAB и повторно суспендируйте шарики в 400 микролитрах боратного буфера. Тщательно перемешайте и дайте инкубации на ротаторе в течение 16-24 часов при температуре 37 градусов Цельсия.

После инкубации отделите шарики с помощью магнитного сепаратора и удалите надосадочную жидкость. Промойте шарики одним миллилитром промывочного буфера и выдержите пять минут при четырех градусах Цельсия, удалите буфер с помощью магнитного сепаратора. Эту стирку повторяют дважды.

Чтобы блокировать свободные группы тосила, добавьте один миллилитр БСА, содержащего трис-буфер, и инкубируйте в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации удалите буфер из шариков с помощью магнитного сепаратора, дважды промойте буфером и аликвотой. Для использования реплицируемая ДНК прикрепляется к стеклянным покровным листкам, функционализированным с помощью Amil lane.

Оксигруппа полосы амила связывается со стеклом, оставляя амин доступным для связывания с биотинилированными молекулами ПЭГ. Это покрытие помогает уменьшить неспецифическое сцепление с поверхностью. Чтобы тщательно очистить стекла от стеклопакетов, поместите их в банки для окрашивания и заполните банки ультразвуком этанола.

В течение 30 минут прополощите банки и залейте одним моляром гидроксида калия на 30 минут и повторите обе промывки. Для первой реакции функционализации необходимо удалить все следы воды. Наполните банки с окрашиванием ацетоном и ультразвуком в течение 10 минут.

Опустошите банки и снова залейте ацетоном. Приступайте к добавлению синусоидального реактива в банки и перемешивайте в течение двух минут. Затем гасят большим избытком воды.

Затем просушите покровные листы, запекав их при температуре 110 градусов Цельсия в духовке в течение 30 минут. Затем приготовьте смесь из расчета около 0,2% от массы на объем. Биотинилированный колышек, включающий в себя стеклянную прокладку для скольжения, позволит отделить покровные стекла, пипетки 100 мкл на сухой силосный покровный слип

Положите сверху вторую крышку. Инкубируйте покровные стекла в растворе PEG в течение трех часов. Затем отделите каждую пару крышек и тщательно промойте водой.

Будьте осторожны, чтобы крышка была функциональной стороной вверх, так как только одна сторона будет покрыта колышком. Наконец, высушите покровные стекла сжатым воздухом и храните их под вакуумом В случае высыхания поверхности остаются стабильными не менее месяца. Таким образом, десятки покровных накладных могут быть изготовлены в партии и использоваться по мере необходимости.

Теперь, когда крышки готовы, можно собрать проточную камеру для эксперимента с одной молекулой. Эксперимент с одной молекулой проводится с использованием простой проточной камеры, сконструированной с функционализированным покровным створкой, двусторонней лентой, квартовым стеклом и трубкой. Для каждого эксперимента с отдельными молекулами подготавливается одна проточная камера.

Начните со смешивания пяти миллилитров блокирующего буфера и 20 миллилитров рабочего буфера и поместите смесь в влагопоглотитель, чтобы удалить любые пузырьки воздуха для последующих этапов. Затем распределите 100 микролитров рабочего раствора strp din в PBS по поверхности колышка функционализированного Cover Slip инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы позволить strp din связать поверхностный биотин. Тем временем отрежьте кусок двустороннего скотча в соответствии с размером кварцевого горлака, отметьте положение отверстий трубки на ленте.

Наметьте проточную камеру, нарисовав центральный канал шириной три миллиметра и прямоугольники, содержащие оба отверстия. Проточные камеры могут быть сконструированы с двумя входными и двумя выходными Y-образными каналами. Теперь разрежьте отмеченную ленту по нарисованному контуру, делая прямые чистые надрезы, чтобы убедиться, что клей не выступает в канал.

Тщательно очистите кварцевое стекло ацетоном, чтобы удалить клей с конструкции проточной ячейки, использованной в предыдущих экспериментах. Найдите наилучшее выравнивание контура канала. Снимите одну сторону клейкой основы и осторожно поместите ленту на горку корта.

Будьте осторожны, чтобы правильно выровнять ленту, так как входные и выпускные отверстия должны оставаться незаблокированными. Затем подготовьте отрез трубки длиной 0,76 миллиметра внутреннего диаметра трубки для входа и выхода проточной ячейки. Отрежьте конец трубки под углом примерно 30 градусов, чтобы трубка не прижималась плашмя ко дну камеры.

Подвесьте трубки на штативы для пробирок для легкого крепления к проточной ячейке на следующих этапах. К настоящему времени инкубация покровного стекла должна быть завершена. Промойте чехол, тщательно пролейте его водой и высушите с помощью сжатого воздуха.

Будьте осторожны, чтобы не перевернуть крышку, так как только одна сторона функциональна колышком. Завершите сборку проточной камеры, сняв другую сторону подложки ленты и поместив кварцевое стекло на защитное стекло Слегка нажмите на защитное стекло, чтобы вытолкнуть воздух, попавший в клей. Это поможет предотвратить попадание пузырьков воздуха в проточный канал.

Заклейте боковые стороны камеры эпоксидной смолой. Вставьте отрезанную трубку в отверстия кварца и запечатайте на месте эпоксидной смолой. Дайте подсохнуть в течение нескольких минут.

После высыхания с помощью иглы 21 калибра протяните часть блокирующего буфера DGA через одну из трубок, чтобы заблокировать поверхность камеры. Промойте несколько раз, чтобы удалить пузырьки воздуха, и дайте камере инкубироваться не менее 30 минут, прежде чем переходить к эксперименту по репликации одной молекулы. После того, как ДНК-матрица функционализировала бусины и проточную камеру, можно проводить эксперимент с одной молекулой.

Для начала поместите проточную ячейку на предметный столик микроскопа. Удерживайте камеру на месте с помощью сценических зажимов и убедитесь, что проточный канал расположен на одной линии с ПЗС-камерой. Подсоедините к ранее изготовленным пневматическим пружинам к шприцевому насосу и к выпускным трубкам проточной ячейки.

Используя соединительную трубку большего диаметра, поместите входные трубки проточной ячейки в блокирующий буфер и потяните шприц назад, чтобы удалить пузырьки воздуха из трубок, осторожно переверните выпускные трубки, чтобы удалить пузырьки воздуха, попавшие в проточную ячейку. После того, как все пузырьки воздуха будут удалены, заткните одну из входных трубок иглой и запечатайте одну из выходных трубок, согнув ее на 180 градусов и закрепив клейкой лентой. Подайте шаблон в камеру с умеренной скоростью потока, чтобы обеспечить хорошее покрытие поверхности ДНК.

Разбавьте раствор бусин до двух-четырех умножить на 10 шестых бусин на миллилитр. В одном миллилитре DGA один x блокирующий буфер. Затем сделайте смесь вихревой и обрабатывайте ультразвуком в течение 20 секунд.

Влейте разбавленный раствор шариков в камеру. После добавления бусин выключите поток и дайте камере достичь равновесия. Затем закройте обе выпускные трубки.

Любые изменения в трубках без закрытой камеры вызовут колебания давления, которые будут оказывать сильное воздействие на бусины и сдвигать связанные молекулы ДНК. Заглушите входную трубку, которая использовалась для загрузки бусин, иглой с помощью второй входной трубки. Начните промывку проточной ячейки с помощью DGAs одним из растворов блокирующей буферной промывки в больших количествах.

Взбалтывайте предметный столик, постукивая, чтобы удалить все бусины, которые специально не прилипли к поверхности, чтобы проверить ее. Бусины привязаны к ДНК. Попробуйте изменить направление потока.

Как только свободные бусины будут достаточно удалены, выключите поток и дайте камере достичь равновесия. Приготовьте свежую реакционную смесь, содержащую репликационные белки, как указано в текстовом протоколе. Закройте открытую выпускную трубку и переключите входной резервуар на свежеприготовленную реакционную смесь.

Медленно открывая выпускное отверстие, чтобы избежать резких изменений давления, продолжайте ферментативную реакцию. Во-первых, подайте белковый раствор в камеру с умеренной скоростью потока, чтобы обеспечить эффективное связывание с ДНК. Выключите поток и дайте камере достичь равновесия.

Закройте выпускные трубки и замените трубку, содержащую реакционную смесь. С помощью трубки, состоящей из промывочного буфера DGA, промойте камеру, чтобы удалить свободные белки после промывки. Снова выключите поток и дайте камере достичь равновесия.

Закройте выпускные трубки и замените трубку с промывочным буфером. В пробирке, содержащей репликационный буфер T-7, репликационный буфер T-7 содержит хлорид магния, который запускает реакцию репликации. Используйте скорость потока 0,012 миллилитра в минуту, что соответствует трем пико-ньюиновым силам сопротивления на тросах ДНК, используя условия, описанные в этом протоколе.

Поместите редкоземельный постоянный магнит над проточной ячейкой перед визуализацией, чтобы предотвратить неспецифические взаимодействия между шариками и поверхностью. Расположите волоконный осветитель под углом падения от 10 градусов и параллельно предметному столику микроскопа рядом с полем обзора микроскопа с объективом 10 x и ПЗС-камерой. Освещение темным полем используется для увеличения контраста в фокусе изображения шарика с помощью привязанного шва.

Начните сбор данных в течение 20–30 минут с низкой частотой кадров. В успешном эксперименте можно одновременно наблюдать 100 бусин. В результате эксперимента должны быть получены многочисленные следы, демонстрирующие синтез ведущей нити ДНК.

Для того, чтобы измерить скорость и процесс раскручивания и полимеризации ДНК, необходимо определить точное положение шариков. Подгоните эти позиции с помощью двумерных гауссовых функций. Визуализируйте траекторию, отслеживая положение валика в каждом кадре с помощью программного обеспечения для слежения.

Затем постройте график положения шва в зависимости от времени с помощью любого графического программного обеспечения для получения данных о расходах. Подгонка графиков с помощью линейной регрессии и расчет наклона для процессивной. Определите общую длину ДНК от начала до конца события укорочения.

Объедините все одиночные измерения и графики распределений скорости и производительности в соответствии с данными с помощью гауссовских и одиночных экспоненциальных функций соответственно. Мы только что показали вам, как измерить скорость и процесс репликации ДНК на уровне одной молекулы. При выполнении этой процедуры важно убедиться, что сила и определенные ставки потока пластинки не влияют на ферментативную активность репликационных белков.

Вот и все. Спасибо за просмотр и получайте удовольствие от своих экспериментов.