Индукционная токсина и белка Извлечение из Fusarium Sрр. Культуры для протеомных исследований

В этом видео описывается процедура, используемая для индуцирования синезиса токсина у некоторых видов в данном случае, а также протокол экстракции целого проте, используемый для протеомных исследований в нашей лаборатории. Продолжительность процедуры: 16 дней, четыре дня для роста грибков, 10 дней для синезина токсина и два дня для экстракции белка. По прошествии четырех дней колонии все еще активно растут к краю плиты.

Типичный воздушный мицелий формируется и собирается с помощью стероидного лезвия под пластинчатой коробкой путем осторожного царапания поверхности пластины. Мицелий разрезают на пять маленьких кусочков и добавляют в раннюю колбу, содержащую 25 миллилитров питательных веществ. Индукция токсинов более эффективна, чем темная пыль.

Колба покрыта алюминиевым покрытием. Затем культуры встряхивают в течение 10 дней по 150 кругов в минуту при температуре 25 градусов по Цельсию. Среда изготовлена из SAPH и содержит высококонцентрированный раствор S-ряда.

Известно, что постель вместе с темнотой способствует синезису токсинов в риа. Затем мицелий отделяют от жидкости, содержащей токсин, путем фильтрации на близких тканях ИМ. Жидкость можно использовать для измерения содержания токсинов, в то время как мицелий используется для экстракции белка.

Чтобы избежать переноса носителей, мой потолок трижды промываю стерильной водой. После этого следует удалить лишнюю воду, например, добавить жидкий азот, а образцы можно хранить при температуре минус 80 или использовать для экстракции белка. Процедура экстракции белка основана на использовании SDS и TCA и состоит из разных этапов лизиса.

Он предложит метод, охватывающий несколько операторов для выполнения. В то же время, когда происходит извлечение биологических репликатов, каждый из них осуществляется разными операторами. Эта процедура учитывает различия в процедуре извлечения, которые могут быть сгенерированы различными операторами, обрабатывающими реплики.

Таким образом, он должен демонстрировать более высокую устойчивость при сравнении биологических репликатов, поскольку операторная переменная включена в репликацию. В то же время использование нескольких операторов сокращает время обработки. Образец измельчают в стерильной ступке с использованием жидкого азота до тех пор, пока мицелий не превратится в мелкий порошок.

Этот шаг имеет решающее значение для качества и количества белков. Мицелий собирается в пробирки по 10 миллитефлоновых в пропорции четыре десятых от общего объема пробирок. Затем добавляется буфер для лизиса, содержащий SDS и различные ингибиторы протеазы.

Затем пробирки встряхивают до получения однородного раствора. Затем образцы встряхивают в течение 30 минут в кодовой камере для дальнейшей гомогенизации, образцы кипятят с целью растворения клеточных стенок и гидрофобных белков. Наличие SDS препятствует образованию олигомеров, которые препятствуют выпадению в осадок белков.

Ступень центрифугирования разделяет три фазы. Белки суспендируются в прозрачном растворе, который собирается в новую пробирку, хранящуюся на льду. Затем палитра используется для выполнения второго этапа, повторяя вихревость, кипячение и центрифугирование.

Шлак из двух лизисов объединяют для того, чтобы выполнить осаждение с ледниковым осаждением, буфером, содержащим кислотный тон, трикислотную кислоту и DTT. Затем образцы хранят в течение 16 часов при температуре минус 20 градусов по Цельсию, чтобы дать доступ белку. Белки осаждения расположены на дне пробирок для улучшения осаждения.

Пробирки центрифугируются на высокой скорости в течение 45 минут. Нёбо теперь хорошо видно. Надосадочные жидкости можно отбросить с помощью пятимиллилитровой прокладки для трубы.

Затем ТСА удаляют путем добавления 25 миллилитров промывочного буфера для ледников, содержащего ацетон и DTT. Затем его тщательно и энергично встряхивают. Затем выполняется новый этап центрифугирования.

Белковое нёбо теперь плавает, поэтому следует сделать усилие, чтобы устранить сна. Выполняется второй этап промывки, в который добавляются промывка, буферизация, встряхивание и центрифугирование. Агент SUP удаляется, а образец высушивается с помощью скоростного мешка.

Когда образец сухой, белок имеет порошкообразную консистенцию. На хранение. Образец белка должен быть собран из пробирки, чтобы уменьшить электростатическую интерференцию пластика.

Используется электростатический пистолет, а белковый порошок собирается с помощью металлического шпателя. Затем белки суспендируются непосредственно в меченом буфере. Используется для 2D dash 30 минут при 800 граммах в минуту.

Достаточно для солюбилизации. Белок перед тем, как приступить к дорогостоящей 2D маркировке. Качество белка проверено на странице SDS одномерного геля, как можно видеть.

Отсутствие значительных мазков на краю полосы свидетельствует о хорошем качестве образца.