Name: Протокол Производство KLRG1 тетрамер (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Узнайте метод получения тетрамеров KLRG1 для анализа лиганд-рецепторных взаимодействий с использованием бактериальной экспрессии и хроматографии. Этот протокол помогает исследователям изучать иммунные механизмы.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы благодарим доктора Найденко за помощь в оптимизации рефолдинг условиях. Эта работа была поддержана исследовательский грант NIH AI58181 Лорана Brossay. Синди Banh поддерживается NIH НРСА F31 AI080230. Стефани Terrizzi и Синди Banh в равной мере участвовать в этой работе.

Подготовка тел включения <ol><li> Привить 4 х 500 мл колб ТБ каждый из которых содержит 50 мкг / мл карбенициллин и хлорамфеникол с ночной культуры бактерий выражения KLRG1 плазмиды конструкции. Когда OD достигает 0,6 А при 600 нм, вызывают с добавлением 0,4 М IPTG и инкубировать культуру дополнительно 4 часа тряски при температуре 37 ° C. </li><li> Ресуспендируют собранных клеток в ресуспендирования буфера рН = 8,0 (50 мМ Трис-HCl, 25% (W / V) сахарозы, 1 мМ EDTA, 10 мМ DTT). Примечание: гранулы могут быть заморожены на данном этапе. </li><li> Бассейн не более 60 мл бактериальной resuspensions в полипропиленовых стакан. При необходимости отрегулируйте до 60 мл с TE буфера рН 8,0 и размешать смесь с половинной скоростью. </li><li> Для перемешивания смеси добавить падение мудрых: лизоцима (окончательный = 1 мг / мл), MgCl2 (окончательный = 5 мм), 2 мг ДНКазы я в 50% глицерин, содержащийся 75 мМ NaCl, Triton-X100 (окончательный = 1%), DVB-T ( Окончательный = 10 мм). </li><li> Разрушать ультразвуком решение на льду в течение 1,5 мин и центрифуги лизатов при 5000 оборотов в течение 10 мин при 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Декантируйте супернатант. </li><li> Добавьте 15 мл промывочного буфера рН = 8,0 (50 мМ Трис-HCl, 0,5% Тритон Х-100, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT). </li><li> На льду, разрушать ультразвуком решение в течение 1,5 мин, пока осадок полностью ресуспендировали. </li><li> Центрифуга образцов при 5000 оборотов в течение 10 мин при 4 ° C. </li><li> Повторите 5 раз мыть. </li></ol></li><li> Повторите 5б промывочным буфером без Тритон Х-100, центрифуги и ресуспендируют в 4 мл буфера ТЕ. </li><li> Возьмите сырой массы тел включения суспензии и хранить в ТЕ буфере при концентрации от 30 до 100 мг / мл. </li></ol> Рефолдинг KLRG1 <ol><li> Сделать 1 л рефолдинг буфер рН = 8,0 (0,4 М аргинин-HCl, 0,1 М Трис рН 8-8.3, 2 мМ ЭДТА, 0,2 мМ PMSF, 3 ЭДТА без ингибитора протеазы таблетки, 5 мМ GSH и 0,5 мМ GSSG) и холод до 4 ° С при перемешивании. </li><li> Подготовка тел включения для закачки в складных смеси: Это идеальное место, чтобы сделать 5 10 инъекций каждый с 0,25 0,5 мкМ концентрации таким образом, чтобы конечная концентрация белка будет 2 3 мкМ. <ol class="lalpha"><li> Растопить объемом 50 мг суспензии телец включения в 7 M GnHCl 10 мМ β-меркаптоэтанола. </li><li> Держите телец включения / GnHCl смеси при температуре 37 ° С в течение 30 - 40 мин и вихревые каждые 5 мин для обеспечения полного плавления (суспензия станет ясно, когда полностью растаял). </li><li> Центрифуга при максимальной скорости в течение 30 мин в микроцентрифужных при 4 ° С и передачи супернатант в 15 мл центрифужную пробирку. Не передать любую из небольших черновато гранул. </li></ol></li><li> Регулировка громкости с впрыском буфера (3 M GnHCl, 10 мМ NaAcetate, рН 4.2,10 мМ ЭДТА). </li><li> Inject 1 мл разведенной телец включения каждый час. Когда инъекций, перемешать на высокой скорости, добавить 1 мл разведенного падение тел включения по капле с 2-х секунд между каждой капли. Когда инъекция делается, перемешать на низкой скорости. </li><li> Продолжить ночь перемешивания при низкой скорости при 4 ° C. </li></ol> Концентрация рефолдинг Реакции <ol><li> После протокол Millipore с, концентрат 1 л предварительно фильтруется (0,22 мкм фильтром) рефолдинг реакции с помощью Amicon мешалкой клеток и YM10 NMWL ультрафильтрации мембрана 10K (Millipore) до ~ 10 мл. </li><li> Концентрат до ≤ 2 мл с использованием Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li></ol> Очистка KLRG1 тетрамер <ol><li> Установка AKTAFPLC при 4 ° С в зависимости от GE Healthcare пособий. </li><li> Purify мономера форме KLRG1 по размеру хроматографии использованием Sephacryl С-200 16/60 с высоким разрешением колонки (GE Healthcare) в 20 HEPES мм и 150 мм NaCl. (См. рисунок 1). </li><li> Концентрат до 1 мл использованием Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li><li> Используйте Бира фермента в соответствии с протоколом алчность с до biotinylate KLRG1 мономера. </li><li> Свободный биотин устраняется по размеру хроматографии, как в 2. </li><li> KLRG1 молекула tetramerized путем смешивания KLRG1 мономера с 4-кратным молярным избытком PE сопряженных стрептавидином (BD Biosciences). </li></ol> Представитель Результаты <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="Рисунок 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 1"></a> Рисунок 1. Представителю положительных результатов от размера Akta FPLC хроматографии из сложил KLRG1. График показывает разделение мономера (83,52 мл), димер (56,36 мл) и мультимера (36,26 мл) форма сложил KLRG1. Пик при 94,25 мл представляет буфер обмена.

<ol><li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li>
<li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li>
<li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li>
<li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li>
<li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+%28KLRG1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

В этом протоколе, показано, как очистить, biotinylate и tetramerize KLRG1. KLRG1 тетрамер могут быть использованы для обозначения KLRG1 лигандов с помощью проточной цитометрии. Хотя рефолдинг условия должны быть проверены эмпирически для каждого белка, других C-типа лектинов может быть tetramerized использованием аналогичных протоколов. Использование tetramerized белков в качестве зондов, лиганды-сиротам C-типа рецепторов лектинов потенциально могут быть идентифицированы.

<table><tbody><tr><td>Фермент BirA и буфер</td><td>Набор для биотинилирования</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Таблетки с комплексным ингибитором протеаз Mini, без ЭДТА</td><td>Реагент</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td>или эквивалент</td></tr><tr><td>Ячейка Amicon с перемешиванием</td><td>Оборудование</td><td>EMD Millipore</td><td>Модель #8400</td><td>или эквивалент</td></tr><tr><td>Ультрафильтрационная мембрана YM10 NMWL 10K</td><td>Расходные материалы для фильтрации</td><td>EMD Millipore</td><td>13642</td><td></td></tr><tr><td>Концентратор YM10 на 15 мл</td><td>Расходные материалы для фильтрации</td><td>EMD Millipore</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>AKTAFPLC</td><td>Оборудование</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>Колонка высокого разрешения Sephacryl S-200 16/60</td><td>Оборудование</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Стрептавидин PE</td><td>Реагент</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>или эквивалент</td></tr></tbody></table>

Протокол Производство klrg1 тетрамер

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Убийца ячейки лектин-подобный рецептор G1 (KLRG1) является трансмембранный гликопротеин II типа тормозных рецепторов принадлежащих тип С лектин-подобный надсемейства. KLRG1 существует как мономер и как дисульфид-связанных гомодимера. Это хорошо сохраняется рецептор находится на самых зрелых и недавно активированных NK клеток, а также на подмножестве эффектор / память Т-клеток. Использование KLRG1 тетрамер, а также другие методы, E-, N-, и R-кадгерины были определены как KLRG1 лигандами. Эти Са 2 +-зависимые межклеточных молекул адгезии состоит из внеклеточного домена, содержащий пять кадгерина повторяет ответственность за межклеточных взаимодействий, трансмембранный домен и цитоплазматический домен, который связан с актином цитоскелета. Генерация KLRG1 тетрамер имеет важное значение для идентификации KLRG1 лигандами. KLRG1 тетрамер также уникальный инструмент для выяснения роли кадгерина и KLRG1 играть в регуляции иммунного ответа и целостности тканей.

Этот протокол описывает производство KLRG1 тетрамер, который является мощным инструментом для анализа KLRG1 лигандами.

Протокол Производство KLRG1 тетрамер

Лектиноподобный рецептор киллеров G1 (KLRG1) представляет собой трансмембранный гликопротеиновый ингибирующий рецептор II типа, принадлежащий к суперсемейству лектинов C-типа. ...

Здравствуйте, я Стефани Рези из лаборатории Лорен Парс на кафедре молекулярной микробиологии и иммунологии Брауновского университета. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру получения тетрамеров K LRG one. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения когерентных взаимодействий K LRG one.Приступим к работе. Сначала инокулируйте четыре колбы объемом 500 мл с буфером TB, содержащим соответствующие антибиотики, бактериями, экспрессирующими плазмидную конструкцию K LRG one, и культивируйте при 37 °C с перемешиванием. Когда OD₆₀₀ достигнет 0,6, индуцируйте экспрессию через T7-промотор, добавив 0,4 M IPTG, и инкубируйте культуру еще четыре часа при 37 °C с перемешиванием. После четырехчасовой инкубации перенесите бактерии в центрифужные пробирки и центрифугируйте культуры в течение 20 минут при 3000 об/мин и 4 °C.При необходимости на данном этапе осадки можно заморозить при температуре -80 °C для последующего использования. Ресуспендируйте собранные клетки в 30 мл буфера для ресуспендирования. Затем объедините бактериальные суспензии в полипропиленвом стакане до достижения объема 60 мл.При необходимости доведите общий объем до 60 миллилитров, добавив дополнительный буфер TE с pH 8, и перемешивайте смесь на плите-мешалке на половинной скорости. В перемешиваемую объединенную суспензию Resus по каплям добавляйте следующие растворы: лизоцим, хлорид магния, DNS 1, TRITON X 100 и, наконец, DTT.Перенесите раствор в центрифужные пробирки для ультрацентрифугирования и обработайте его с помощью ультразвукового гомогенизатора с амплитудой 30%. Проводите соникацию раствора на льду в течение 1,5 минут, затем центрифугируйте лизат при 5 000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4 °C, слейте супернатант и добавьте 15 мл промывочного буфера. Повторяйте соникацию аналогичным образом до полного ресуспендирования осадка, затем повторите центрифугирование; повторите этапы промывки, соникации и осаждения пять раз.Наконец, ресуспендируйте осадок, используя промывочный буфер, не содержащий Triton X 100. Еще раз центрифугируйте и ресуспендируйте в четырех миллилитрах ТЕ-буфера. Полученный материал представляет собой тельца включения.Определите количество телец включений по сырой массе. Суспензию телец включений можно хранить при температуре 4 °C в стоковых буферах с концентрацией от 30 до 100 mg/mL. После подготовки телец включений можно приступать к рефолдингу.Начните процедуру рефолдинга с приготовления свежего одного литра буфера для рефолдинга; перемешивайте при низкой скорости при 4 °C для охлаждения. Далее подготовьте семь порций суспензии телец включения для введения в буфер для рефолдинга. Сначала разморозьте стоковую суспензию телец включения в микроцентрифужной пробирке, содержащей конечный объем 1.4 мл 7 M гуанидина гидрохлорида и 10 mM β-меркаптоэтанола, на водяной бане при 37 °C в течение 30–40 минут.Перемешивайте на вортексе каждые пять минут. О завершении плавления свидетельствует осветление суспензии.Центрифугируйте расплавленную смесь на максимальной скорости в течение 30 минут в микроцентрифуге при температуре four degrees Celsius. Затем, стараясь не захватить частицы небольшого черноватого осадка, перенесите супернатант в центрифужную пробирку объемом 15 milliliter.Доведите объем до 7 mL с помощью буфера для инъекции. Сначала установите высокую скорость перемешивания смеси для фолдинга. Затем добавьте 1 mL разведенных телец включений.Добавляйте раствор по каплям, соблюдая интервал в две секунды между каплями. Вводите по 1 мл разбавленных телец включений с интервалом в один час между инъекциями. Верните скорость перемешивания на низкий уровень.Продолжайте перемешивание на низкой скорости при температуре 4 °C в течение ночи. После этого белки будут готовы к концентрированию и очистке. Для начала концентрирования рефолдированных тетрамеров KLRG1.Сначала проведите предварительную фильтрацию реакционной смеси с помощью фильтра с размером пор 22 мкм. Затем сконцентрируйте реакционную смесь с одного литра до примерно 10 мл, используя ячейку с перемешиванием Millipore Amicon и ультрафильтрационную мембрану с номинальным пределом молекулярной массы 10 кДа в соответствии с инструкциями производителя. После этого, используя ультрафильтрационную мембрану Millipore с пределом молекулярной массы 10 кДа, проведите дальнейшее концентрирование до объема ≤ 2 мл.Подготовьте хроматографическую систему в соответствии с инструкциями производителя. Мы используем систему быстрой жидкостной хроматографии белков GE healthcare ACTA при температуре 4 °C с колонкой высокого разрешения. Очистите мономерную форму K lrg в 20 мM HEPES и 150 мM NaCl с помощью эксклюзионной хроматографии.Объем вводимого образца должен составлять менее 2% от общего объема геля в колонке. Снова используя ультрафильтрационную мембрану Millipore с пределом отсечения 10 килодальтон, сконцентрируйте мономер KLG один до конечного объема одного миллилитра в соответствии с инструкциями производителя. Удалите свободный биотин, проведя очистку, как было описано ранее, с помощью эксклюзионной хроматографии для получения тетрамера.Смешайте мономеры KL LRG one с четырехкратным молярным избытком тетрамеров стрептавидина, конъюгированных с FICO rine, которые теперь доступны для маркировки рецепторных лигандов. На этом графике показан положительный результат разделения рефолдированных белков K lrg one с помощью эксклюзионной хроматографии (слева направо). Пики иллюстрируют мультимерную, димерную и мономерную формы K LRG one.Пик в крайней правой части соответствует смене буфера. Хотя условия рефолдинга необходимо подбирать эмпирически для каждого белка, другие лектиновые рецепторы C-типа также должны тетрамеризоваться при использовании аналогичного протокола, что позволит идентифицировать и другие лиганды. Мы только что продемонстрировали вам способ получения тетрамера KLRG при выполнении данной процедуры.Важно не забывать проверять уровни индукции и строго соблюдать условия рефолдинга. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.

a-protocol-for-the-production-of-klrg1-tetramer

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Способность производить трансгенов...

Производство С. Элеганс Трансгенов через Recombineering с GalK Выбор маркера

Биофизические и биохимические исследования взаимодействий между мембраной вложенных областей белка сталкиваются со многими техническими проблемами, первым из которых является получение соответствующего учебного материала. В этой статье описывается протокол для получения и очистки дисульфида стабилизированного трансмембранного пептидных комплексов, которые подходят для структурного анализа по решению ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и других аналитических приложений.

Производство дисульфид-стабилизировались трансмембранного пептидные комплексы для структурных исследований

Белковые комплексы катализируют ключевые клеточные функции. Подробные функциональные и структурные характеристики многих важных комплексов требует рекомбинантного производства. MultiBac является бакуловирус / клетка насекомого разработана специально для выражения эукариотических белков и их комплексов. MultiBac был реализован как открытая платформа доступа, и стандартных оперативных процедур разработаны для максимального использования ее полезности.

MultiBac белкового комплекса добывающей платформы на EMBL

Kindlins имеют основополагающее значение для клеточной адгезии через интегринам но исследования них были затруднены трудности встречаются в выражении их рекомбинантно в бактериальных хозяевах. Мы описываем здесь методы их эффективного производства в бакуловирусом-инфицированных клетках насекомых.

Эффективное производство и очистка рекомбинантного мышиного Kindlin-3 от клетках насекомых биофизической исследований

КРИСПР-ассоциированный протеин Cpf1 может управляться специально разработанной РНК CRISPR (crRNA) для расщепления двухцепочечной ДНК на желаемых участках, создавая липкие концы. Основываясь на этой характеристике, был установлен стандарт сборки ДНК (C-Brick), и здесь описывается протокол, подробно описывающий его использование.

Протоколы для сборки ДНК ДНК C-Brick с использованием Cpf1

Здесь мы представляем строка Ассамблеи gRNA клонирования (STAgR), метод легко мультиплекс gRNA векторов ТРИФОСФАТЫ/Cas9 подходов. STAgR делает gRNA мультиплексирования простой, эффективной и настраиваемые.

Настраиваемый протокол для строки Ассамблеи gRNA клонирование (STAgR)

Этот протокол описывает, как создать систему репортер, который может использоваться для идентификации и количественной оценки взаимодействия рецептор лиганд.

Репортер BW системы для изучения взаимодействия рецептор лиганд

Представлен протокол для выполнения одномолекулярной рецензной передачи энергии Фюрстера для изучения разрешения HJ. Двухцветные переменные возбуждения используется для определения констант диссоциации. Одноцветный промежуток времени smFRET затем применяется в анализах расщепления в режиме реального времени, чтобы получить распределение времени пребывания до разрешения HJ.

Одномолекулярная Фюрстерская резонная передача энергии Методы для реального времени Исследование Холлидей Джанкшн Резолюция GEN1

В данной работе описывается методология получения штаммов L. panamensis и L . donovani , экспрессирующих ген eGFP в виде стабильного интегрированного трансгена с использованием системы pLEXSY. Трансфицированных паразитов клонировали путем предельного разведения, а клоны с самой высокой интенсивностью флуоресценции у обоих видов были отобраны для дальнейшего использования в скрининговых анализах на наркотики.

Развитие штаммов видов Leishmania с конститутивной экспрессией eGFP

В этой статье представлен пошаговый протокол, демонстрирующий, как модульное клонирование (MoClo) может быть адаптировано для клонирования полицистронных оперонов.

Стандартизированная модульная сборка полицистронных оперонов с модульным клонированием (MoClo) с использованием инструментария In-Cloning

В этом исследовании был установлен метод, использующий расширение генетического кода для успешного включения лактиллизина (Klac) в определённые участки человеческой энолазы-1 (hENO1) и суперпапки GFP (sfGFP) в клетках Escherichia coli и млекопитающих.

Сайт-специфическая лактилирование лизина через расширение генетического кода в клетках E. coli и млекопитающих

Узнайте метод получения тетрамеров KLRG1 для анализа лиганд-рецепторных взаимодействий с использованием бактериальной экспрессии и хроматографии. Этот протокол помогает исследователям изучать иммунные механизмы.

Протокол Производство KLRG1 тетрамер

Больше видео