Undecalcified Подготовка костей для гистологии, гистоморфометрии и флуорохромами Анализ
8 января 2010 г.
Undecalcified гистологии костей дает важную информацию для различных клинических и научных исследований. Это технически сложно, особенно крупные экземпляры размером. В этом видео показан процесс получения хороших разделы качества и демонстрирует технические трудности и методы их преодоления.
Гистология декальцинированной кости позволяет изучить микроархитектонику костной ткани, демонстрируя как минерализованные, так и клеточные компоненты, что дает жизненно важную информацию о метаболизме костной ткани, ее формировании и резорбции. Это имеет огромное значение для различных клинических и исследовательских приложений. Данный метод позволяет получать качественные изображения и применять такие методы, как флуоресцентный анализ и гистооптометрия.
Выполнение гистологического анализа подкальцинированной костной ткани является технически сложной задачей, особенно при работе с крупными образцами. В данном видео будут продемонстрированы технические трудности и методы их преодоления для получения срезов кости под кальцификатом. Видео не охватывает вопросы гистоморфометрической оценки этих срезов.
Для этого мы рекомендуем обратиться к следующей важной публикации. В данном видео будут рассмотрены подготовка образцов и фиксация, заливка, изготовление срезов (как шлифованных, так и резаных), подготовка предметных стекол и окрашивание после сбора тканей. Образец.
В данном случае шейный отдел позвоночника овцы помещают в герметичный непрозрачный контейнер, содержащий 10% фосфатно-буферный раствор. Для последующего анализа флуорохромов необходимо минимизировать воздействие света. Поскольку флуорохромы чувствительны к свету, образец переносят в лабораторию и подрезают до нужного размера, что улучшает фиксацию и обеспечивает его подходящий размер для помещения в блок.
На данном этапе необходимо знать ориентацию ткани на предметном стекле, чтобы блок можно было подготовить в правильной плоскости. Безопасность имеет первостепенное значение, поэтому следует использовать инструменты таким образом, чтобы руки находились вне зоны досягаемости лезвия. Теперь область интереса обрезают до нужного размера.
Затем выполняется окончательная обрезка с помощью ленточной пилы с меньшим полотном, что позволяет минимизировать потерю ткани. После того как блок будет обрезан до нужного размера, его помещают в герметичный непрозрачный контейнер со свежим фиксирующим раствором для завершения фиксации. Объем контейнера должен примерно в 10 раз превышать размер образца.
Для достижения надлежащей фиксации образец должен оставаться в формуле и растворе от одной до двух недель, в зависимости от его размера, после чего его переносят в 70% Ethanol. Далее проводится постепенная проводка, поскольку большой размер блоков и низкая проницаемость кости обуславливают медленную диффузию растворителей. Затем осуществляется дегидратация с использованием возрастающих концентраций этанола и последующее просветление в бутаноле. Образец хранят в защищенном от света месте при постоянном перемешивании.
Мы рекомендуем выдерживать образец в каждом растворе примерно одну неделю. Таким образом, процесс подготовки занимает от четырех до шести недель. Не следует торопиться, так как это может ухудшить итоговое качество срезов.
Для кальцинированной костной ткани доступен широкий выбор вариантов заливки. Выбор смолы или метакрилата зависит от того, какой анализ планируется провести. Например, не все виды смол совместимы с иммуногистохимическим анализом.
Эпоксидные смолы требуют УФ-излучения для отверждения, что может помешать флуорохромному анализу. Мы рекомендуем ознакомиться со спецификациями производителя перед тем, как сделать тщательный выбор. Мы используем TEVI 7, 100, так как это позволяет получать качественные срезы и шлифы для световой микроскопии и флуорохромного анализа, а также является экономически эффективным решением.
Важным аспектом при заливке является необходимость максимально близкого соответствия плотности кости и плотности заливочной среды. Это имеет критическое значение при последующем разрезании блоков, особенно при изготовлении микротомических срезов. Смесь готовится в соответствии с инструкциями производителя и тщательно перемешивается путем интенсивного встряхивания. Для оптимизации протокола целесообразно провести предварительную заливку нескольких контрольных образцов.
В отличие от работы с парафином, этот этап является необратимым. Блоки помещают в форму поверхностью для среза вниз. Форма должна быть больше блока для обеспечения поддержки и прочности.
Инфильтрацию метакрилатом следует проводить медленно, чтобы обеспечить максимальное проникновение метакрилата в кость. Снова следует минимизировать воздействие света. Через одну неделю использования инфильтрационного раствора его заменяют, и добавляют раствор для отверждения.
Затем изготавливается опорная пластина. Для этого мы используем tevit 30 40. После этого форму снимают, и блок готов к использованию.
Метод шлифования позволяет получать более толстые срезы толщиной от 20 до 50 микрон. Это полезно для флуоресцентного анализа, так как более толстые срезы обеспечивают более яркую флуоресценцию. Для изготовления шлифованного среза требуется микротом, предпочтительно с алмазным ножом. Мы используем изогнутый алмазный нож толщиной 0,6 миллиметра.
Необходимо использовать смазочное средство. Мы рекомендуем смазку на нефтяной основе, хотя силиконовые смазки также эффективны. Затем блок помещают в зажим.
Блок закрепляется в макрозахжимe и перемещается к ножу. Первый срез обнажает режущую поверхность и позволяет ориентировать блок; этот срез следует удалить.
Шлифовка — это медленный процесс, который не следует ускорять. При шлифовке среза необходимо обеспечить достаточное смазывание. Затем срез помещают на предметное стекло.
При необходимости образец можно очистить и отполировать. Срез имеет тенденцию скручиваться, поэтому мы рекомендуем накрыть его частью зип-пакета и зафиксировать в плоском положении с помощью другого предметного стекла, зажатого зажимом.
Затем образец помещают в инкубатор при температуре от 60 до 80 °C на один час. Это размягчает methacrylate и помогает срезу плотно и ровно прилечь к предметному стеклу. Здесь представлено комбинированное флуоресцентное изображение трех различных флуорохромов, введенных с интервалом в один месяц.
Это позволяет определить место минерализации в конкретный момент времени. Дозы и способ приготовления этих меток указаны в тексте. Метод микротомии позволяет получить тонкие срезы, которые лучше всего подходят для световой микроскопии.
Это технически сложный процесс. Мы рекомендуем использовать микротом со сменными ножами (sledge microtone), так как он обеспечивает дополнительную жесткость, необходимую для резания этих твердых блоков. Можно использовать различные типы лезвий, в том числе карбид-вольфрамовые.
Тем не менее, мы рекомендуем использовать лезвие из нержавеющей стали, так как его можно легко и часто затачивать по мере необходимости. Лезвие должно быть ориентировано под углом 45 градусов к блоку. Плотность метакрилата зависит от многих факторов, включая влажность воздуха в помещении.
Следовательно, блок следует хранить в сухом месте. При необходимости размягчение можно добиться, приложив к блоку влажную бумагу; может потребоваться несколько срезов для достижения подходящих условий резания и получения качественного среза. Затем пакет с зажимом и дополнительный предметное стекло используются для распрямления среза перед его помещением в инкубатор.
Окрашивание аналогично стандартному гистологическому анализу тканей, залитых парафином, за исключением того, что пропитка парафином очевидно не требуется. К распространенным методам окрашивания костной ткани относятся VSA с контрастным окрашиванием шафраном, окрашивание шафраном, светлым зеленым (light green) и масс-золотым астроном (mass on golden as trione). Протоколы этих методов приведены в тексте.
Реагенты подбирают и фильтруют перед использованием. Golden. Этот краситель часто применяется в гистооптометрии. Мы рекомендуем предварительно оптимизировать окрашивание на тестовых препаратах.
После каждого этапа препарат можно осмотреть под микроскопом, чтобы убедиться в правильности окрашивания. Это позволяет подобрать оптимальное время экспозиции для каждого компонента красителя. После оптимизации стандарта окрашивания все препараты из эксперимента окрашивают одновременно в одной кассете по одному и тому же протоколу, чтобы избежать вариабельности окрашивания, которая может повлиять на его термическую геометрию.
Затем предметные стекла будут заклеены покровными стеклами стандартным способом. Желаем вам удачи в проведении эксперимента.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Гистологическое исследование недекальцинированной кости имеет решающее значение для понимания микроархитектуры костной ткани, включая минерализованные и клеточные компоненты. В данном видео демонстрируются технические сложности и методы получения качественных срезов из крупных образцов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Гистология костной ткани
- Клиническое применение
- Методология исследований
Теоретические основы
- Обмен и формирование костной ткани имеют жизненно важное значение для здоровья.
- Недекальцинированные срезы позволяют получить детальные изображения структуры кости.
- Такие методы, как флуоресцентная оценка, расширяют возможности анализа.
- При гистологической подготовке крупных образцов возникают определенные трудности.
Цель исследования
- Продемонстрировать процесс получения качественных срезов недекальцинированной костной ткани.
- Осветить технические трудности при гистологической подготовке.
- Предложить решения для преодоления этих проблем.
Используемые методы
- Подготовка недекальцинированных образцов кости.
- Методы изготовления срезов крупных образцов.
- Методы визуальной оценки.
- Демонстрация гистологических методов.
Основные результаты
- Успешное получение высококачественных срезов костной ткани.
- Выявление распространенных технических проблем.
- Эффективные методы преодоления трудностей при подготовке образцов.
- Углубленное понимание микроархитектоники кости.
Выводы
- Гистология недекальцинированной костной ткани имеет важное значение для клинического применения и научных исследований.
- Технические сложности можно эффективно преодолеть с помощью надлежащих методов.
- Качественные срезы позволяют получить ценные сведения о состоянии костной ткани.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Гистологический анализ недекальцинированной костной ткани позволяет напрямую визуализировать минерализованные и клеточные компоненты кости, предоставляя важные данные о костном обмене, образовании и резорбции кости. Этот подход способствует валидации мишеней в моделях скелетных заболеваний за счет сохранения нативной архитектуры ткани для количественного анализа. Данный метод повышает прогностическую достоверность доклинических исследований, обеспечивая возможность лонгитюдной оценки динамики минерализации с помощью флуорохромного мечения.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы за счет сохранения как минерализованных, так и клеточных компонентов костной ткани для механистического анализа.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков путем прямого наблюдения процессов формирования и резорбции кости в образцах, имеющих значение для изучения заболевания.
- Трансляционная ценность: повышает уверенность в выборе мишени, позволяя сопоставлять гистологические конечные точки с функциональными результатами в доклинических моделях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Предоставляет данные количественной гистоморфометрии и флуорохромного анализа для стандартизированной оценки скорости минерализации костной ткани.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость анализа за счет стандартизированных протоколов изготовления срезов, окрашивания и визуализации, применимых при работе с большими объемами образцов.
- Трансляционная ценность: Способствует подготовке к скринингу, генерируя количественные временные данные о минерализации, подходящие для оценки соединений в скелетной фармакологии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает непрерывность системы исследования заболеваний, позволяя осуществлять лонгитюдное отслеживание метаболизма костной ткани от этапа поиска до стадий доклинической валидации.
- Операционная ценность: Обосновывает решения о переходе на следующие этапы разработки с учетом рисков, предоставляя количественные данные о фенотипе кости, подтвержденные гистоморфометрически.
- Трансляционная ценность: Повышает точность прогнозирования и снижает риски за счет прямой корреляции паттернов флуорохромного мечения с временными событиями минерализации в исследованиях терапевтического вмешательства.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в общий процесс разработки лекарственных средств: от ранней валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, что особенно актуально для препаратов, воздействующих на костную ткань, и фармакологических исследований безопасности скелета.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей регуляции, обеспечивая возможность прямой визуализации активности остеобластов и остеокластов в недекальцинированной ткани.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированных протоколов шлифовки и резания срезов, которые позволяют получать количественные результаты флуоресценции и гистоморфометрии.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения зависимых переменных, включая скорость аппозиции минерала, скорость формирования кости и временные шкалы минерализации по флуорохромам для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: связывает фундаментальные открытия с преклинической практикой, обеспечивая возможность лонгитюдной оценки динамики обновления костной ткани, что критически важно для валидации моделей скелетных заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую гистологическую платформу для программ фармакологии скелета посредством стандартизированных рабочих процессов заливки смолой, секционирования и окрашивания, применимых к нескольким моделям костей и терапевтическим методам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности за счет прямой количественной оценки процессов образования и резорбции кости без артефактов, возникающих при декальцинации.
- Практическая ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря валидированным протоколам заливки, сечения и окрашивания крупных плотных образцов.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки средств терапии заболеваний скелета за счет снижения механистической неопределенности конечных точек обновления костной ткани.
- Влияние на портфель разработок: Приоритезация кандидатов препаратов для воздействия на костную ткань с учетом рисков на основе сигналов доклинической эффективности и безопасности, подтвержденных гистоморфометрически.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в области гистологии костной ткани, методах заливки смолами и протоколах работы с флуорохромами.
- Необходимы специализированные приборы, включая санные микротомы, макротомы с алмазным ножом и условия обработки с защитой от света для обеспечения стабильности флуорохромов.
- Требуется стандартизация сроков фиксации, дегидратации и инфильтрации между исследовательскими группами для обеспечения качества срезов в крупных образцах с низкой проницаемостью.
- Необходимо учитывать особенности адаптации к различной плотности костей и размерам образцов, что требует использования сред для заливки с соответствующей плотностью и увеличения времени обработки.
- Существуют практические ограничения, такие как необратимость этапов заливки, светочувствительность флуорохромов и артефакты в виде скручивания срезов, требующие механического распрямления при монтировании.
