Мозаика данио рерио трансгенез для оценки Enhancer Последовательности

Здравствуйте, меня зовут Эрика Кги из лаборатории Шеннон Фишер на факультете клеточной биологии и биологии развития Университета Пенсильвании. Меня зовут Крис Вебер, я тоже из Лаборатории Фишера. А меня зовут Шеннон Фишер.

Сегодня мы покажем вам процедуру анализа функции энхансерных элементов с помощью трансгенеза рыбок данио. Мы используем эту процедуру для изучения транскрипционной регуляции генов, важных для развития скелета. Итак, приступим.

Для идентификации некодирующих последовательностей, окружающих гены-кандидаты, мы используем алгоритм fast cons, который доступен в виде трека в браузере генома uc SC. В первую очередь нас интересуют гены, экспрессируемые во время скелетного развития, но тот же подход может быть использован для изучения любых генов, экспрессируемых на ранних этапах развития. В приведенном здесь примере мы идентифицировали консервативные последовательности.

В интервале, окружающем ген бампера человека, мы исследуем весь интервал до соседних генов и определяем низкий по размеру порог специфической логарифмической оценки, соответствующий примерно верхним 5% некодирующей последовательности. После выбора последовательностей спроектируйте праймеры с использованием праймера три для амплификации каждой последовательности из генома человека, праймеры ДНК должны быть выбраны для амплификации консервативной области плюс 30 или более пар оснований с каждой стороны. Амплифицируйте интересующую область с помощью высококачественной полимеразы с использованием геномной ДНК человека, используйте стандартные лабораторные процедуры молекулярной биологии для клонирования амплифицированного продукта в вектор экспрессии.

Вектором, используемым в этом протоколе, является шлюз PG wc FOS GFPA. Вектор назначения. После создания вектора велим транспонировать.

Фермент, необходимый для транспозиции, сначала транскрибируется in vitro с помощью машинного набора M message M от Ambion и плазмиды PGB 600 перед экспериментальными инъекциями. Проверьте эффективность каждой партии транспотов, вводя им известный усилитель, такой как носки для мыши. 10 усилитель.

Чтобы подготовиться к инъекциям, вытяните иглы, используемые для микроинъекций, из капиллярного стекла с диаметром 1,2 миллиметра на съемник микропипеток Sutter P 97. Используйте программу, которая дает сильный наконечник с острым конусом для проникновения в неповрежденные корионы с чистым лезвием бритвы и микрометрическим предметным стеколом. Разбейте наконечники вручную под стереомикроскопом до внешнего диаметра примерно 15 микрометров.

Иголки можно хранить в течение суток в закрытой посуде для хранения. Поддерживайте популяцию рыб данио в регулярном светлом темном цикле с 14 часами света в стандартных условиях за день до выполнения микроинъекций. Готовьте рыб к спариванию по времени в небольших аквариумах для разведения.

Поместите трех самок или двух самцов в аквариум в параллельные ряды утром в день микроинъекций вскоре после начала светового цикла. Соедините самцов и самок в чистой системе очищенной воды для яйценоскости. Часто проверяйте рыбу и собирайте икру в течение нескольких минут после производства, чтобы получить хорошо синхронизированные партии.

Поддерживайте яйценоскость в течение двух-трех часов, продолжая смешивать свежие группы рыбы в течение всего утра с помощью широкого отверстия стеклом диаметром пять с четвертью дюймов мимо пипетки, оснащенной латексной грушей. Отсортируйте собранные зародыши в чашки Петри размером 60 на 15 мм, частично заполненные зародышевой средой группами по 50 зародышей. Отметьте собранное время на крышке каждой посуды.

Для каждой собранной кладки эмбрионов сохраняйте чашку с 50 эмбрионами для инъекционного контроля между сборами яйцеклеток. Приготовьте свежие растворы для инъекций, смешав следующие ингредиенты в микропробирке, и храните на льду. Заложите иглы для инъекций в посуду для удержания и залейте от 1,5 до двух микролитров раствора для инъекций.

С помощью пипетирования капли 500 нанолитров капают на широкий конец каждой иглы. Жидкость будет притягиваться к кончику за счет капиллярного действия. Подготовьте не менее двух игл для каждого раствора для инъекций.

Загрузите заполненную иглу в ручной иглодержатель пневматического пиконасоса или аналогичного инжектора давления. Сконфигурирован и подключен к баллону с азотом в соответствии с инструкциями производителя. Откалибруйте объемы впрыска путем измерения диаметра капель, выбрасываемых в минеральное масло, на предметном стекле на микрометрическом предметном стекле (обычно время впрыска составляет 120 миллисекунд).

При давлении 20 PS я получу каплю размером примерно в один нанолитр с помощью стереомикроскопа с увеличением от 6 до 10 раз. Удерживайте эмбрион на месте с помощью пары тонких щипцов и проталкивайте инъекционную иглу с постоянным давлением через корион в желток эмбриона на одноклеточной или ранней двухклеточной стадии, расположите кончик иглы в желтке чуть ниже бластомеров, вытолкните примерно один литр раствора для инъекций и извлеките иглу для каждой конструкции, которую мы вводим больше или равны 200 эмбрионам после завершения инъекции. Отсортируйте эмбрионы, удалив неоплодотворенные яйцеклетки, поврежденные эмбрионы и неудачные инъекции или эмбрионы без фенола красного цвета у богохульников.

Затем мы инкубируем эмбрионы и среду для эмбрионов при температуре 28,5 градусов Цельсия до подходящего времени для наблюдений. Теперь мы покажем вам некоторые репрезентативные результаты энхансерных элементов, которые производят тканевые паттерны экспрессии GFP в эмбрионе данио-рерио. Мы изучаем гены, экспрессируемые в костях или хрящах во время исследования.

Вот пример энхансера, находящегося выше гена акана, который регулирует экспрессию в черепно-лицевых хрящах через три дня после оплодотворения. Вот еще один усилитель, на этот раз из гена бампера, который регулирует экспрессию в костных клетках. В течение пяти дней из многих энхансеров, которые мы идентифицировали, мы обнаружили небольшую корреляцию между расположением относительно гена и регуляцией экспрессии.

При выборе последовательностей для тестирования важно помнить, что энхансер может находиться на сотни килооснований выше или ниже по потоку от гена или в одном из интронов, как это видно у этого эмбриона. Значительная часть последовательностей, по-видимому, не регулирует тканевую специфическую экспрессию. Они часто демонстрируют очень слабую флуоресценцию или могут иметь несколько рассеянных клеток в двух общих местах эктопической экспрессии: эпидермисе и скелетных мышцах.

Мы только что показали вам, как идентифицировать потенциальные энхансеры с помощью сохранения последовательности и проверить их функцию с помощью мозаичного трансгенеза у рыбок данио. При проведении этой процедуры важно проверить качество вашей ДНК и РНК для инъекций. Также убедитесь, что вы внимательно осмотрели все введенные эмбрионы, особенно если вы ожидаете сцеживания только в небольшой группе продаж.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.