ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы благодарим г-жа Паула Рой за отличную хозяйства рыба, и Стив Ekker для рода даром pDB600 плазмиды. Эти исследования были профинансированы за счет гранта в СФ от NHGRI.

<ol><li>Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+biological+relevance+of+putative+enhancers+using+Tol2+transposon-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).</li>
<li>Balciunas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. Westerfield, M. , 3 ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (1995).</li>
</ol>

Мы показали, подход, используемый в нашей лаборатории для эффективного анализа потенциальных усилителей использованием данио трансгенез. Чаще всего мы используем этот подход, чтобы искать тканеспецифические усилители связанные с человеческими генами. Несмотря на отсутствие очевидных гомологическая последовательность большую часть времени между человеком и рыбой некодирующих последовательностей, мы находим, что этот подход, как правило, успешными в определении усилители для гены, представляющие интерес для нас. Критическ...

<table><tbody><tr><td>Takara LA Taq</td><td>Takara Bio Inc</td><td>RR02M</td><td></td></tr><tr><td>Набор для TA-клонирования pCR8/GW/TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K2500-20</td><td></td></tr><tr><td>Смесь ферментов Gateway LR Clonase II</td><td>Invitrogen</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>Компетентные клетки для создания библиотек DH5&amp;alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>12535-019</td><td></td></tr><tr><td>Компетентные клетки для создания библиотек DB3.1</td><td>Invitrogen</td><td>11782-018</td><td></td></tr><tr><td>Набор mMESSAGE mMACHINE</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Набор для выделения плазмид HiSpeed Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>Набор для очистки ПЦР-продуктов QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Вытягиватель микропипеток Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Пневматический микронасос PicoPump</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr></tbody></table>

Мозаика данио рерио трансгенез для оценки enhancer Последовательности

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

Завершение геноме человека, а также многих других видов, высветил проблемы приписывая определенную функцию, не кодирующих последовательностей. Один известный функция осуществляется без кодирования долю генома состоит в регулировании транскрипции генов, однако, Есть нет эффективных методов широко предсказать цис-регуляторных элементов от первичной последовательности ДНК. Мы разработали эффективный протокол функционально оценки потенциальных цис-регуляторных элементов через данио трансгенез. Наш подход дает значительные преимущества по сравнению с клеточной культуры, основанной методы развивающих важные гены, так как он содержит информацию о пространственной и временной регуляции генов. С другой стороны, это быстрее и дешевле, чем аналогичные опыты на трансгенных мышах, и мы регулярно применять ее к последовательности изолированы от человеческого генома. Здесь мы показываем, наш подход к выбору элементов для тестирования на основе сохранения последовательности и наш протокол для клонирования последовательностей и microinjecting их в данио эмбрионов.

Мы демонстрируем наш подход к поиску потенциальных элементов усилителя от умственно регулируемых генов и оценки их функции через мозаику трансгенез рыбок данио.

Мозаика данио рерио трансгенез для оценки Enhancer Последовательности

Завершение секвенирования генома человека, а также геномов многих других видов, выявило проблему определения конкретных функций некодирующих...

Здравствуйте, я Эрика Кги из лаборатории Шеннон Фишер на кафедре клеточной и биологии развития Пенсильванского университета. Я Крис Вебер, также из лаборатории Фишер. И я Шеннон Фишер.Сегодня мы продемонстрируем процедуру анализа функции энхансерных элементов с помощью трансгенеза у zebrafish. Мы используем этот метод для изучения транскрипционной регуляции генов, имеющих важное значение для развития скелета. Итак, приступим.Для идентификации некодирующих последовательностей, окружающих гены-кандидаты, мы используем алгоритм fast cons, который доступен в виде трека в браузере генома uc SC. В первую очередь нас интересуют гены, экспрессируемые в процессе развития скелета, однако этот же подход можно использовать для изучения любых генов, экспрессируемых на ранних стадиях развития. В приведенном здесь примере мы идентифицировали консервативные последовательности.В интервале вокруг человеческого гена bumper мы исследуем весь участок до соседних генов и определяем низкий порог логарифмического балла для конкретного размера, соответствующий примерно верхним 5% некодирующей последовательности. После выбора последовательностей с помощью программы Primer3 разработайте праймеры для амплификации каждой последовательности из геномной ДНК человека; праймеры следует подобрать таким образом, чтобы амплифицировать консервативный регион плюс 30 или более пар оснований с каждой стороны. Амплифицируйте интересующий регион с использованием высококачественной полимеразы и геномной ДНК человека, затем примените стандартные лабораторные методы молекулярной биологии для клонирования амплифицированного продукта в экспрессионный вектор.В данном протоколе используется вектор PG wc FOS GFPA gateway. Вектор-реципиент. После создания вектора следует выполнить транспозицию.Фермент, необходимый для транспозиции, сначала транскрибируют in vitro с использованием набора M message M machine от Ambion и плазмиды PGB 600 перед проведением экспериментальных инъекций. Каждую партию транспозаз следует протестировать на эффективность, проведя инъекцию с известным энхансером, таким как mouse socks. 10 enhancer.Для подготовки к инъекциям вытяните иглы для микроинъекций из филаментного капиллярного стекла диаметром 1,2 мм с помощью вытягивателя микропипеток Sutter P 97. Используйте программу, которая обеспечивает создание прочного кончика с резким сужением, чтобы иметь возможность проникать через неповрежденный хорион с помощью чистого лезвия бритвы и предметного стекла с микрометром. Обломите кончики вручную под стереомикроскопом до достижения внешнего диаметра примерно 15 мкм.Иглы можно хранить в течение одного дня в закрытой чашке для хранения. За день до проведения микроинъекций поддерживайте популяцию zebrafish в стандартных условиях с регулярным циклом свет/темнота (14 часов света).В утро дня микроинъекций, вскоре после начала светового цикла, поместите в аквариумы по три самки или по два самца, расставив их параллельными рядами. Для получения икры поместите самцов и самок вместе в чистую системную обработанную воду. Часто проверяйте рыб и собирайте икру в течение нескольких минут после ее появления, чтобы получить хорошо синхронизированные партии.Поддерживайте сбор икры в течение двух-трех часов, продолжая объединять новые группы рыб в течение всего утра, используя стеклянную пипетку с широким отверстием диаметром 5,25 дюйма, оснащенную латексной грушей. Распределите собранные эмбрионы по чашкам Петри размером 60×15 мм, частично заполненным средой для эмбрионов, группами по 50 эмбрионов. Укажите время сбора на крышке каждой чашки.Из каждой собранной порции эмбрионов отберите 50 штук в отдельную чашку для использования в качестве неинъецированного контроля между сборами икринок. Приготовьте свежие растворы для инъекций, смешав следующие ингредиенты в микроцентрифужной пробирке, и храните их на льду. Поместите инъекционные иглы в чашки-держатели и заполните их от 1.5 до 2 µL раствора для инъекций.Нанесите пипеткой капли объемом 500 nanoliter на широкий конец каждой иглы. Жидкость поднимется к кончику иглы за счет капиллярного эффекта. Подготовьте как минимум две иглы для каждого раствора для инъекций.Поместите заполненную иглу в ручной держатель пневматического пико-насоса или аналогичного инъектора давления, настроенного и подключенного к баллону с азотом в соответствии с инструкциями производителя. Откалибруйте объемы инъекций, измерив диаметр капель, вытесненных в минеральное масло на предметном стекле с микрометрической шкалой; обычно время инъекции составляет 120 milliseconds.При давлении 20 PS с помощью стереомикроскопа при увеличении от 6 до 10 x я получу каплю объемом примерно один нанолитр. Удерживая эмбрион тонким пинцетом, плавным и равномерным движением проколите хорион иглой для инъекций и введите её в желток эмбриона на стадии одной или ранней двухклеточной стадии; расположите кончик иглы в желтке непосредственно под бластомерами, введите примерно один нанолитр раствора для инъекции и извлеките иглу. Для каждого конструкта мы вводим раствор в ≥ 200 эмбрионов. После завершения инъекций проведите сортировку эмбрионов, удалив неоплодотворенные яйца, поврежденные эмбрионы, случаи неудачных инъекций или эмбрионы, в бластомерах которых отсутствует феноловый красный.Затем мы инкубируем эмбрионы и среду для эмбрионов при 28.5 °C до наступления подходящего времени для наблюдений. Теперь мы продемонстрируем некоторые репрезентативные результаты работы элементов энхансеров, которые создают тканеспецифичные паттерны экспрессии GFP в эмбрионе zebrafish. Мы изучаем гены, экспрессируемые в костной или хрящевой ткани в течение.Ниже приведен пример элемента-энхансера, расположенного выше гена acan, который регулирует экспрессию в хрящевой ткани черепно-лицевого отдела на третий день после оплодотворения. Здесь представлен другой энхансер, на этот раз гена bumper, который регулирует экспрессию в клетках костной ткани. На пятый день, анализируя множество выявленных нами энхансеров, мы обнаруживаем слабую корреляцию между их расположением относительно гена и регуляцией экспрессии.При выборе последовательностей для тестирования важно помнить, что энхансер может находиться за сотни килобаз выше или ниже гена или в одном из интронов, как видно на данном эмбрионе. Значительная часть последовательностей, по всей видимости, не регулирует тканеспецифическую экспрессию. В таких случаях часто наблюдается очень слабая флуоресценция или наличие нескольких разрозненных клеток в двух типичных местах эктопической экспрессии: в эпидермисе и скелетных мышцах.Мы только что продемонстрировали, как идентифицировать потенциальные элементы энхансеров с помощью анализа консервативности последовательностей и проверить их функцию с помощью мозаичного трансгенеза у zebrafish. При выполнении данной процедуры важно проверить качество ДНК и РНК, используемых для инъекций. Также обязательно тщательно осмотрите все инъецированные эмбрионы, особенно если экспрессия ожидается только в небольшой группе клеток.На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.

mosaic-zebrafish-transgenesis-for-evaluating-enhancer-sequences

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Шаг за шагом ведет к генерации целевого химерных эмбрионов данио путем трансплантации в бластулы или гаструлы.

Создание химерных эмбрионов данио рерио по трансплантации

Временным и пространственным разрешением генетических манипуляций определяет спектр биологических явлений, что они могут нарушать. Здесь мы используем во времени и пространстве...

Ориентация обонятельных нейронов лампы с использованием комбинированных В Vivo Электропорация и Gal4 основе Enhancer Ловушка данио рерио Линии

Этот протокол описывает метод генной ловушки инсерционного мутагенеза с использованием Gal4-VP16 в качестве основного репортера и GFP / RFP качестве вторичного журналистами в рыбок данио. Примерно один из десяти высокого выражения F0 гена выход рыбы ловушки потомство коэкспрессирующей GFP и RFP. Процедура скрининга могут быть легко масштабируется для адаптации к размеру лабораторией, проводящей инсерционного мутагенеза экран.

Джин Захват Использование Gal4 в данио рерио

Данио-рерио является мощной модельной системой для изучения биологии развития и болезней человека из-за их генетического сходства с высшими позвоночными. Этот протокол описывает методологию создания гаплоидных эмбрионов данио-рерио, которые могут быть использованы для стратегий прямого скрининга для выявления рецессивных мутаций в генах, необходимых для раннего эмбриогенеза.

Производство гаплоидных эмбрионов данио по<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Оплодотворение

Цель этого исследования - продемонстрировать, как стратегия мозаичного трансгенеза может быть использована у рыбок данио для быстрой и эффективной оценки относительного вклада нескольких онкогенов в инициацию и прогрессирование опухоли in vivo.

Мозаика данио рерио Трансгенез для функционального геномного анализа потенциальных совместных генов в опухолевых патогенеза

Здесь мы описываем рабочий процесс использования системы TetON для достижения тканеспецифической экспрессии генов в регенерирующем хвостовом плавнике взрослой рыбки данио.

Использование Титон системы для изучения молекулярных механизмов регенерации данио рерио

Визуализация динамического поведения органелл и других субклеточных структур in vivo может пролить свет на их функцию в физиологических и патологических условиях. В данной работе мы представляем методы генетической маркировки двух органелл, центросом и митохондрий, а также визуализации их динамики в живых эмбрионах рыбок данио-рерио с помощью широкоугольной и конфокальной микроскопии.

Визуализация субклеточных структур в эмбрионе данио Living

В этой работе представлена ​​новая модель сегментарного повреждения почек in vivo с использованием трансгенного даниофата почки GFP. Модель позволяет индуцировать целенаправленную абляцию эпителиальных клеток почек, чтобы показать клеточные механизмы повреждения и восстановления нефронов.

Точный подход к клеточной абляции для моделирования острой почечной недостаточности при развитии рыбок данио

В данной работе представлен метод разработки, характеристики и отслеживания в режиме реального времени метастазирования опухоли в модели нейробластомы рыбок данио, в частности в трансгенной линии рыбок данио с гиперэкспрессией MYCN и LMO1, которая развивает метастазирование спонтанно.

Модель метастазов нейробластомы рыбок данио

В этой работе описывается протокол модульной системы трансгенеза Tol2, метода клонирования на основе шлюза для создания и введения трансгенных конструкций в эмбрионы рыбок данио.

Система Zerio Tol2: модульный и гибкий подход к трансгенезу на основе шлюза

Изучите метод мозаичного трансгенеза Danio rerio для анализа функций энхансеров, регулирующих транскрипцию генов скелетного развития. Этот подход позволяет идентифицировать ключевые регуляторные последовательности ДНК.

Мозаика данио рерио трансгенез для оценки Enhancer Последовательности

Больше видео