Одноместный Recordings сенсиллы в Насекомые Дрозофилы И Anopheles gambiae

В данном видео демонстрируется способ проведения одиночных записей синаптической активности у Drosophila melanogaster. Подготовленные одоранты в растворе камеди гуммиарабик наносятся пипеткой на бумажные полоски, которые затем вставляются в пастернажские пипетки. Живых насекомых фиксируют для иммобилизации обонятельных органов. Насекомое помещают под микроскоп и вводят референтный электрод в глаз насекомого.

Затем регистрирующий электрод вводят в обонятельный центум. С помощью пипетки в область центума подают порцию запаха и регистрируют нейронную активность. Здравствуйте, я Лесли Вазаль из лаборатории Вазаля в Университете Рокфеллера, а я Мариза Пеллегрино, также из лаборатории Вазаля.

Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру регистрации активности обонятельных сенсорных нейронов дрозофилы *Drosophila melanogaster* и малярийного комара *Anopheles gambiae*. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения механизмов работы обонятельных сенсоров у насекомых и того, как нейроны реагируют на летучие химические вещества. Итак, приступим.

Начните выполнение данной процедуры с заточки электродов, которые будут использоваться для регистрации. С помощью дрели просверлите в стенке шприца объемом 20 литров небольшое отверстие диаметром около двух миллиметров на расстоянии одного сантиметра от кончика. Заполните шприц фильтрованным 0,5 молярным раствором гидроксида калия и закрепите его горизонтально на штативе под диссекционным микроскопом так, чтобы кончик шприца находился в поле зрения; вставьте электрический провод в отверстие в шприце, следя за тем, чтобы он не перекрывал выходное отверстие, и подключите его к аноду источника питания.

С правой стороны микроскопа закрепите шток держателя электрода на ручном микроманипуляторе. Затем с помощью зажима «крокодил» подсоедините электрический кабель к основанию штока держателя электрода. Подключите кабель к катоду источника питания.

Вставьте кусок вольфрамовой проволоки длиной 5 см в держатель электрода и прикрутите его к штоку манипулятора. Установите мощность источника питания на шесть делений.

При наблюдении под диссекционным микроскопом введите электрод в кончик шприца так, чтобы 90% длины электрода находилось в растворе. Через одну минуту медленно извлеките электрод, затем введите его снова. На этот раз в контакт с раствором должно входить только 50% электрода.

Через 30 секунд снова извлеките электрод. Повторите этот процесс 10 раз, каждый раз погружая иглу так, чтобы 50% электрода находилось в контакте с гидроксидом калия. После затачивания электрод готов к использованию в экспериментах.

Начните подготовку системы подачи одоранта, разрезав хроматографическую бумагу на полоски размером 3 мм на 5 см; на каждую полоску нанесите пипеткой 30 µL выбранного одоранта. Затем поместите полоску в стеклянную пипетку. Присоедините к пипетке отрезок воздушного шланга длиной около 3 см.

Затем используйте соединитель, чтобы перекрыть трубку, и отложите подготовленные одоранты. Далее с помощью лезвия бритвы разрежьте пластиковую серологическую пипетку объемом 10 миллилитров на отметке 4 миллилитра сверху и удалите заостренный конец. Затем с помощью небольшого сверла просверлите два отверстия: одно на отметке -1,5 миллилитра, другое — на отметке -0,5 миллилитра.

Затем вставьте наконечник дозатора объемом 200 µL в разрезной соединитель и плотно вставьте соединитель в срезанный конец пипетки объемом 10 mL. Закрепите пипетку на магнитном штативе и расположите ее рядом с микроскопом. После этого с помощью пневматического шланга подключите серологическую пипетку к воздушному насосу и разместите рядом с ней пипетки с одорантами, готовые к использованию.

Затем вкрутите электроды в держатель для электродов, а зонд — в манипуляторы на установке микроскопа. Поместите фрагмент покровного стекла на стоматологический воск под углом 30 градусов, следя за тем, чтобы воск не закрывал верхнюю часть стекла. Затем поместите фрагмент стоматологического воска в центральную часть микроскопа.

Теперь поместите на предметное стекло дополнительный кусочек воска меньшего размера, как показано здесь, поверх первого. Установите стеклянный капилляр, вытянутый с помощью вертикального пуллера. Изготовьте аспиратор для мух, вставив обрезанный наконечник пипетки объемом 200 microliter в один конец отрезка авиационной трубки длиной 120 centimeter.

Закройте другой конец трубки кусочком сетки размером 1.5 сантиметр на 1.5 сантиметр и закрепите его, накрыв обрезанным наконечником дозатора на один миллилитр. Теперь с помощью аспиратора для мух перенесите взрослую муху из флакона.

Поймайте муху, закрыв кончик аспиратора для мух наконечником объемом 200 мкл. Затем подуйте в трубку, чтобы переместить муху к концу наконечника объемом 200 мкл. С помощью лезвия бритвы обрежьте широкий конец наконечника пипетки в нескольких миллиметрах от мухи.

Быстро введите стоматологический воск, чтобы зафиксировать муху под диссекционным микроскопом. Обрежьте кончик пипетки рядом с головой мухи, стараясь не повредить ее, используя тонкий наконечник пипетки. Проталкивайте воск до тех пор, пока примерно половина глаз мухи не выйдет за пределы кончика пипетки.

Следите за тем, чтобы ноги не выставлялись наружу, так как они могут помешать записи. Закрепите муху на кусочке воска головой вверх. Затем поместите воск на предметное стекло рядом с покровным стеклом, как показано здесь.

Слегка подтолкните воск, чтобы антенна выпрямилась и легла на стекло. Зафиксируйте антенну, поместив стеклянный капилляр в желобок между вторым и третьим сегментами антенны. После размещения мухи на предметном стекле перенесите его под микроскоп, используемый в установках для записи и подачи одорантов, при малом увеличении.

Расположите антенну примерно посередине поля зрения. Осторожно опустите электрод сравнения и разместите его рядом с глазом. Затем опустите регистрирующий электрод и расположите его рядом с антенной.

Увеличьте увеличение и переместите антенну в центр поля зрения. Поместите устройство для подачи запаха рядом с головой мухи, направив его на антенну. Вернитесь к малому увеличению с помощью микроманипулятора.

Введите референсный электрод в глаз мухи. Опустите регистрирующий электрод над антенной, не касаясь ее поверхности. Затем, используя микроманипулятор, снова переключитесь на большое увеличение.

Введите регистрирующий электрод в любой точке вдоль всей длины синапса; при правильном расположении электрода можно обнаружить спонтанную активность в клетках сенсора. При необходимости электрод можно продвинуть глубже или даже полностью через сенсор для получения лучшего соотношения сигнал/шум. Для регистрации ответов на одоранты соедините пастурную пипетку с воздушным насосом с помощью трубки и подайте порцию одоранта (в данном случае метилацетата), активировав воздушный насос примерно на одну секунду при скорости потока около 220 milliliters per minute.

С помощью электрического аспиратора соберите от 40 до 63 комаров в возрасте пяти дней в небольшую пластиковую клетку. Поместите клетку на лед примерно на 15 минут для анестезии комаров. После того как комары перестанут двигаться, перенесите от четырех до шести особей на предметный столик диссекционного микроскопа.

Как самцы, так и самки. Комары могут быть использованы для регистрации. У самцов.

У самцов антенны имеют перистые очертания, в то время как у самок они нитевидные. С помощью тонкого пинцета удалите крылья и ноги комаров, чтобы иммобилизовать их. После удаления крыльев поместите комаров в увлажненный пластиковый стакан, чтобы предотвратить их высыхание. На предметное стекло с помощью диссекционного микроскопа наклейте два кусочка двустороннего скотча длиной 1 cm параллельно друг другу с расстоянием примерно 1 cm между ними в центре и сбоку; затем с помощью пинцета поместите одного комара на бок.

На центральную ленту. Один глаз прилипнет к ленте. Отрегулируйте положение верхнечелюстных пульп так, чтобы обе они располагались на ленте параллельно.

Зафиксируйте челюстные щупики, закрепив тонкие нити (например, человеческий волос) у основания и у кончика щупиков. После того как комар будет размещен на предметном стекле, перенесите его в установку для записи. При малом увеличении расположите челюстные щупики примерно посередине поля зрения, а голову — сверху; поворачивайте предметный столик до тех пор, пока один из щупиков не окажется под прямым углом.

Отрегулируйте высоту регистрирующего электрода таким образом, чтобы электрод сравнения располагался непосредственно над глазом комара, а регистрирующий электрод — рядом с максиллярными пальпами. Расположите устройство для подачи запаха как можно ближе к пальпам.

Введите электрод сравнения в глаз. Переключитесь на объектив 100x и вставьте регистрирующий электрод в штифт на пальпаторе. Как только электрод окажется в сентуме, можно будет зафиксировать спонтанную активность клеток.

Как и в случае с записью ответов дрозофилы, ответы на одорант индуцировались путем подачи одоранта — в данном случае OCT 3 — путем соединения задней пипетки, содержащей запах, с воздушным насосом и последующей активации насоса. Теперь мы представим несколько репрезентативных записей как от обонятельных сенсорных нейронов дрозофилы, так и от нейронов oph. В зависимости от условий и качества записи на одной трассе можно выделить различное количество обонятельных нейронов в большой базальной дендритной цилии drosophila melanogaster; например, от двух до четырех клеток, что должно проявляться в виде разной амплитуды спайков во время записи.

На данном рисунке представлены записи, полученные от двух клеток AB двух lum drosophila. Записи от клетки A показаны синим цветом, а записи от клетки B — зеленым; при нанесении парафинового масла ни одна из клеток не активируется. Как показано на рисунке слева, только клетка A реагирует на метилацетат в максиллярном щупальце OPIS gambier; в бороздчатых колышках и soum содержатся три клетки, но легко различимы только две. Здесь.

Записи, выделенные зеленым цветом, отражают ответ B-клеток на первый одорант, OCT three. Мы только что продемонстрировали вам способ регистрации активности обонятельных сенсорных нейронов дрозофилы *Drosophila melanogaster* и малярийного комара *Anopheles gambiae*. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости стабильной подготовки препарата и использования тонкого стеклянного электрода для успешного проведения записей.

На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.