Синтез и калибровка Фосфоресцирующая нанозонды для кислорода изображений в биологических системах

Мы представляем принципы кислорода измерения фосфоресценции закалки и анализа проекта порфирина основе дендритных наносенсоров для кислорода изображений в биологических системах.

Представлена конструкция фосфоресцирующих зондов для кислорода на основе DER из платины и палладия. Зонды состоят из металлического порфиринового ядра, инкапсулирующего дендрон, и периферического гидрофильного полиэтиленгликолевого слоя, конструкция зондов, а их калибровка будет проиллюстрирована в этой статье. Здравствуйте, меня зовут Луис Синкс.

Я работаю с профессором Сергеем Ов здесь, на кафедре биохимии и биофизики Университета Пенсильвании. Я Эммануэль Лосис, тоже из Vina. Я толстый также из, И я Сергей Васильевич.Биологические измерения кислорода фосфором и гашение используют экзогенный фосфор и зонды, которые вводятся непосредственно в интересующую среду.

Зонды крови или интерстициальной жидкости являются единственным инвазивным компонентом схемы измерения, требующим особого внимания к их конструкции. Сегодня мы покажем вам процедуру синтеза и калибровки дендритных фосфоресцирующих нанозондов для измерения кислорода и биологических систем. Мы используем эту процедуру для синтеза и определения характеристик зондов для полу- и двукратных измерений кислорода.

Итак, приступим. Прежде чем мы начнем конструировать зонды, давайте сначала рассмотрим основную теорию фосфоресценции зонда. Фосфоресценция происходит из долгоживущего триплетного состояния.

Молекула зонда должна быть спроектирована таким образом, чтобы давать высокий квантовый выход триплетного состояния и излучать фосфоресценцию вместо флуоресценции. Возбуждение зондов происходит одним фотоном или, в случае специальных двухфотонных усиленных зондов, двухфотонным механизмом. Возбуждение одним фотоном обычно обеспечивает меньшее пространственное разрешение, но требует более простых приборов и может использоваться для одноточечных измерений с волоконно-оптическими периметрами на основе светодиодов.

Находясь в триплетном состоянии, зонд может сталкиваться с молекулами кислорода, что может деактивировать триплетное состояние — процесс, называемый гашением. Поэтому в присутствии кислорода время жизни фосфоресценции сокращается. В результате гашения зависимость времени жизни триплетного состояния от количества кислорода в окружающей среде характеризуется уравнением Фольмера Стерна.

В экспериментах in vivo зонд вводится в кровь или интерстициальную жидкость животного, а поверхность ткани освещается светом соответствующей длины волны, чтобы привести зонд в возбужденное триплетное состояние. Для того чтобы измерить время жизни фосфоресцирующих фотонов, испускаемые фосфоресцирующие фотоны являются двукратными по времени. Например, после импульса возбуждения в течение первых пяти микросекунд может быть собрано 3 609 фотонов, в течение следующих пяти микросекунд — 1 421 фотон и так далее, пока фотоны не будут собраны.

Числа в ячейках, построенные в зависимости от времени, дают распад фосфоресценции, который анализируется для определения времени жизни фосфоресценции. При визуализации эта процедура применяется к каждому пикселю изображения, что приводит к созданию фосфоресцирующих карт времени жизни. Измерения времени жизни нечувствительны к неоднородностям распределения зонда по всему объекту, что характерно для биологических образцов.

Теперь давайте посмотрим, как конструировать зонды. Начните процедуру синтеза с добавления ароматического альдегида в молярный раствор тетрагидро изоиндола 0,01. Перемешайте реакционную смесь в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре.

Затем добавьте бор, трифторид датил, съели и продолжайте помешивать еще два часа. Далее добавьте дихлорид голубой, бензохинон или DDQ, в результате чего получится цвет. Смените бледно-красный цвет на темно-зеленый и оставьте смесь на ночь при непрерывном помешивании на следующий день, промойте и высушите раствор, а затем сконцентрируйте его в вакууме.

Reg кристаллизация остатка дает мишень в виде зеленого порошка. Выход обычно составляет около 50%.Затем обработайте свободноосновной порфирин ацетатом палладия. Контролируйте преобразование с помощью УФ-спектроскопии.

Преобразование завершается после того, как мыльная полоса Диона между 468 и 472 нанометрами исчезает. Порфирин выделяют методом колоночной хроматографии на силикагеле. Для приготовления тетрабензопорфирина палладия окисляют тетра циклопорфирина.

Во время отражения цвет меняется с темно-красного на насыщенный зеленый, испаряют растворитель, разбавляют остаток дихлорметаном смывают, сушат и концентрируют органическую фазу в вакууме. После хроматографии на силикагеле изолят палладия тетрабензопорфирин в виде порошка голубого цвета. Далее гидролизуют периферические этрогруппы палладия трабом бензопорфирином.

Сначала обработайте тетрабензопорфирин Эстер основанием в тетра гидропурине. Затем продолжить гидролиз и водную основу, осадить порфирин путем добавления соляной кислоты и высушить его в вакууме. На этом синтез порфирина завершается.

Теперь давайте посмотрим, как синтезировать энтроны. Прежде чем зонды будут собраны, энтроны, которые являются ветвями Дании, должны быть предварительно синтезированы. Мы используем аэрогли, те же РЭРы, которые можно удобно приготовить из недорогих материалов исследования методами без хроматографии.

Тероны с аминогруппами в фокусных точках затем присоединяются к карил-группам на phy, которые мы только что показали вам, как создать. Затем сложные эфирные группы на периферии ДМЭ гидролизуются аналогично карбоксильным группам на периферии порфирина. На этом этапе, начиная с поликарбоновой кислоты Porphyrin DME, можно синтезировать либо один, либо два фотонных зонда для синтеза двух фотонных зондов.

Сначала расходятся и прикрепляют несколько двухфотонных фрагментов антенны к нескольким карбоксильным группам на нижней периферии. Теперь приступаем к модификации оставшихся остатков карбоновой кислоты на камере. Начните с добавления в 1,25 раза большего количества HBTU в высококонцентрированный раствор порфиринового римера и перемешивайте реакционную смесь при комнатной температуре в течение 10 минут.

Теперь добавьте диизопропилэтиламин и метоксиполиэтиленгликоламин. Перемешивайте реакционную смесь в течение двух суток при комнатной температуре, а затем добавьте этиловый эфир. Отделите форму для осаждения центрифугированием и повторно осадите ее из тетраэдрана несколько раз, добавив эфир датила.

Наконец, очистите зонд с помощью эксклюзионной хроматографии на гранулах полистирола с использованием тетраэдрана в качестве растворителя. Теперь давайте рассмотрим определение характеристик и калибровку датчиков. Спектры поглощения и излучения зонда получают с использованием растворов одного микромолярного зонда в условиях окружающей среды с помощью стандартного спектрофотометра и стационарного флуориметра.

Далее для получения кормового калибровочного графика Ульмера, позволяющего соотнести срок службы зонда с концентрацией кислорода, помещаем раствор зонда в специальную цилиндрическую ветку. Вете расположен внутри камеры с регулируемой температурой внутри светонепроницаемой клетки с портами для возбуждения и излучения оптических волокон. Закройте вету пробкой, в которую вставлен высокочувствительный кислородный электрод типа Кларка.

Пробка также имеет два игольчатых отверстия для входа и выхода Аргоннского отверстия. Установите температуру от 36 до 37 градусов Цельсия и оставьте раствор помешиваться, пока он не достигнет равновесия. Подключите возбуждающее волокно к возбуждающему контуру цифрового фосфофонного периметра, управляемого ПК.

Источником света и периметром фоса является светодиод высокой мощности, выход которого контролируется цифро-аналоговой платой с частотой 333 килогерц. Эмиссионное волокно подключено к другому оптическому порту по периметру фоса, который соединен с инфракрасным чувствительным лавинным фотодиодом. Выходной сигнал диода усиливается и подается в рекламный канал той же платы управления, что обеспечивает синхронизацию между каналами возбуждения и излучения.

Домашнее управляющее программное обеспечение генерирует импульсы возбуждения любой желаемой длины с последующим сбором фосфоресцентного распада. Выходной сигнал кислородного электрода усиливается и направляется на другую аналоговую цифровую плату на том же компьютере. Это низкочастотная плата, не более одного килогерца, которая используется для регистрации электродного тока в выбранные моменты времени, обычно 10 раз в секунду.

температура раствора уравновешивается, одновременно инициализируются программы фоса и электрода. Для выполнения измерений каждые 10 секунд их выходные данные синхронно записываются в два отдельных файла. После этого Argonne подключается к впускному порту на ветеринарной пробке.

По мере того, как Аргонна течет по поверхности перемешанного раствора, она постепенно замещает кислород. Это приводит к уменьшению электродного тока и увеличению времени жизни фосфора, который измеряется по периметру фоса. Обычно кислород вытесняется из раствора целиком.

Примерно через два часа после титрования данные электродов и время жизни фосфора импортируются в стандартную программу анализа, которая создает график обратного времени жизни фосфора в зависимости от парциального давления кислорода. Этот график подогнан по прямой линии методом наименьших квадратов, чтобы задать постоянную кислородного гашения в качестве его наклона. Срок службы фосфоресцирующих веществ получается либо при той же посадке, либо непосредственно при измерении при нулевом содержании кислорода.

Титрование можно повторить с использованием раствора зонда в присутствии альбумина, белка, присутствующего в плазме крови, чтобы имитировать условия, встречающиеся в крови животного in vivo. Полученные кормовые участки Ульмера должны быть идентичны, если ЭР защищает зонд. Ну, а колышковые группы изолируют зонд от контакта с альбумином.

В качестве предложения здесь были выбраны этапы синтеза кислорода, затем обработаны зонды и проведена их калибровка. При выполнении калибровки. Важно убедиться, что условия максимально приближены к условиям интересующей биологической системы.

Важно убедиться, что молекула зонда не подвержена влиянию биомолекул, таких как альбумин. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи с вашим опытом.