Робототехника и динамического анализа изображения для исследования экспрессии генов в тканях растений

В этой процедуре динамика экспрессии генов в тканях растений визуализируется с течением времени с помощью робототехники, сначала семена лимской фасоли стерилизуются и помещаются между увлажненными бумажными полотенцами в контейнере для культуры тканей для проращивания. Через четыре дня коаны удаляются и бомбардируются конструкцией ДНК, содержащей промотор, слитый с GFP, коан, помещенный в чашки Петри, установлен на двумерную роботизированную систему сбора изображений. Робот запрограммирован на съемку изображений каждого кусочка ткани каждый час в течение 100 часов.

Изображения подвергаются анализу изображений, в которых получают количественные данные об интенсивности экспрессии GFP с течением времени. Здравствуйте, меня зовут Джон Файнер, я директор Лаборатории трансформации растений на факультете садоводства и растениеводства Университета штата Огайо. Я Карлос Эрандес Гарсия, аспирант выпускной лаборатории в Университете штата Огайо.

Сегодня Карлос покажет вам протокол, который мы разработали для анализа экспрессии генов и растительных тканей с использованием зеленого флуоресцентного белка. Мы используем эту методику, разработанную нами в лаборатории, для измерения деформации активности OD. Чтобы сделать это, мы промоторизуем нашу первую корону выше гена GFP, который является нашими репортерными генами.

Я покажу вам, как мы внедряем управление промотором в Lima vein Cataly и отправляем приложение на нашу роботизированную систему захвата изображений по индивидуальному дизайну. В заключение я расскажу о нашем протоколе анализа изображений. Итак, приступим к началу этой процедуры поверхностной стерилизации семян лимской фасоли с помощью стандартных процедур.

Поместите стерилизованные семена в семь контейнеров пурпурного цвета GA между слоями влажных и бумажных полотенец и инкубируйте их в течение четырех дней при температуре 25 градусов Цельсия. Здесь мы используем вектор экспрессии с большим числом копий, полезный для анализа промоторов и промоторных элементов. Этот вектор содержит ген GFP, который используется для визуализации функции промотора или промоторного элемента в трансформированных тканях примерно за один-два часа до бомбардировки.

Акцизный лимский боб CU свинец из семенных оболочек. Свинец CU, пригодный для бомбардировки, должен быть от желтого до светло-зеленого цвета, плоский и без каких-либо повреждений, которые могут помешать дальнейшему анализу изображения, сразу после эксцизии поместить 12 кубического свинца в чашку Петри с питательной средой OMS, содержащей соли MS, витамины группы В, 3% сахарозы и 0,2% желе при pH 5,7. Затем осадите конструкцию ДНК на частицы вольфрама M 10 Сначала, прямо перед использованием, повторно суспендируйте частицы в стерильной воде до концентрации 100 миллиграммов на миллилитр.

Затем в пробирку объемом 0,6 миллилитра добавьте 25 микролитров частиц, пять микролитров ДНК по одному микрограмму на микролитр, 25 микролитров 2,5 молярного хлорида кальция и 10 микролитров 100 миллимоляров сперматозоидов. Инкубируйте препарат ДНК на льду в течение пяти минут, затем удалите и выбросьте 50 микролитров раствора поверх частиц. Повторно суспендируйте частицы, покрытые ДНК, которые остаются на дне пробирки, путем вортексирования.

И сразу после вортекса достаньте два микролитра Eloqua. Повторите этот шаг вортексинга. Каждый раз, когда Eloqua удаляется, покрытые оболочкой частицы следует держать на льду и использовать в течение 15 минут.

Теперь, когда ДНК покрыта частицами, поместите два микролитра частиц через верхнюю часть шприцевого фильтра в центре фильтрующего экрана. Затем поместите шприцевой фильтр в блок удержания фильтра внутри пистолета для впуска частиц или камеры СКР. Поместите лимскую фасоль со свинцом осевой стороной вверх на перегородку, которая состоит из сита, расплавленного на дне стакана.

Поместите перегородку, которая используется в качестве платформы для поддержки тканей во время бомбардировки, в корпусную камеру пистолета. Чтобы бомбардировать ткань, сначала откройте клапан, ведущий к вакууму, чтобы откачать камеру. Когда вакуум достигнет 760 миллиметров ртутного столба, активируйте соленоид и высвободите гелий, чтобы привести в движение частицы.

Давление гелия, используемое для ускорения частиц, составляет от 50 до 60 фунтов на квадратный дюйм. После бомбардировки частицами закройте клапан вакуумной линии и сбросьте вакуум с помощью выпускного клапана. Когда вакуум будет высвобожден, откройте дверцу камеры, чтобы извлечь подвергшийся бомбардировке свинец и вернуть его на дальнюю сторону.

Питательная среда до OMS для количественного определения и профилирования экспрессии. Бомбардируйте как минимум тремя свинцами для каждой конструкции ДНК. Также включен положительный контроль, который дает хорошо изученный профиль экспрессии генов.

Теперь ведущие операторы готовы к визуализации. Включите ртутную лампу и подождите 30 минут, чтобы лампа нагрелась. Включите источники питания для камеры SPOT R-T-C-C-D и контроллера двигателя, который приводит в движение специально разработанную роботизированную платформу, вмещающую восемь пластин.

Установите набор фильтров для обнаружения GFP, выбрав набор двух фильтров GFP с возбуждением 480 нанометров и излучением 510 нанометров на трехдиссекционном микроскопе MZ L. Далее простерилизуйте загустевшие поликарбонатные крышки чашек Петри, распылив 70% этанол. Специализированные крышки, используемые для покрытия основания чашки Петри, предотвращают образование конденсата во время сбора изображений.

Поместите пластины с бомбардированным цуаном на платформу робототехники и затяните боковой установочный винт, чтобы закрепить их на месте. Теперь откройте пользовательское программное приложение, которое управляет как платформой робототехники, так и получением изображений. Также откройте программный переключатель контроллера белого света с помощью программного обеспечения, сориентируйте платформу в исходное положение.

Это делается перед выходом на позиции. Для каждого провода няньки на вкладке мотора выберите первую пластину. Платформа будет располагать центр чашки Петри под объективом микроскопа.

С помощью кнопок подвижного расстояния необходимо точно расположить первый CU LEADIN для сбора изображений. Используя функцию живого режима, переместите свинец для объятий в соответствующую область обзора Для первого свинца для объятий используйте ручки на препарирующем микроскопе, чтобы установить фокус и установите увеличение на 1,6x. После того, как область интереса будет установлена, нажмите кнопку «Добавить эту позицию».

Программное обеспечение добавит координаты этого региона в файл графика положений, и платформа вернется к центру установленных позиций пластин для всех оставшихся коенов на пластинах. С помощью кнопок подвижного расстояния используйте три ручных выравнивающих винта, расположенных под каждой пластиной на роботизированной платформе, чтобы отрегулировать фокус для оставшейся коаны на той же пластине. После того, как все координаты всех коан были введены, сохраните координаты графика позиций.

Введите параметры коллекции изображений, такие как тип света, который синий для GFP и настройка экспозиции, а также укажите, где хранить изображения, как описано в прилагаемом письменном протоколе. Перейдите на вкладку контроля времени захвата и установите интервал времени получения изображения и общее количество циклов сбора изображений. Изображения обычно собираются каждый час в течение 100 часов.

Создание четко определенных профилей экспрессии генов. Начните получение изображения, открыв вкладку графика позиций, а затем нажав на кнопку графика прогона. Изолируйте систему сбора изображений от постороннего света в конце 100-часового сбора изображений.

Изображения с высоким разрешением, размером около пяти мегабайт каждое, готовы к анализу. Используйте готовое изображение, чтобы собрать 100 последовательных изображений из каждой папки. Импортируйте все последовательные изображения в виде кадров и измените их размер до 800 на 600 пикселей, чтобы ускорить обработку изображений.

Далее используйте метки на новом слое, который виден на всех кадрах и используя выделенные пятна GFP на образе. Вручную выровняйте каждое изображение, когда выравнивание будет завершено, удалите слой, используемый в качестве образца, и сохраните файл как один файл PSD. Кроме того, экспортируйте все кадры в один файл MOV с использованием самого высокого разрешения.

Теперь файлы готовы к началу количественной оценки GFP. Используйте изображение J, чтобы открыть файл MOV и обрезать область размером 400 на 300 пикселей. Затем разделите последовательные изображения на красный, синий и зеленый каналы с помощью инструмента разделения RGB для красного и зеленого каналов.

Вычтите фоновую флуоресценцию с помощью вычитаемого измеренного ROI для каждого инструмента плагина среза. Рассчитайте выражение GFP, настроив пороговые уровни и используя плагин, предназначенный для измерения среднего значения шкалы серого на пиксель и общего количества пикселей, выражающих GFP. Скопируйте выходные значения на изображении J. Наконец, вставьте выходные значения для зеленого и красного каналов в Microsoft Office.

Excel для дальнейшей обработки данных, чтобы дать вам представление о результатах выравнивания изображения. Эта первая анимация показывает неточность изменения положения роботизированной платформы во время 100-часового эксперимента. Движение пятна является артефактом, возникающим в результате неспособности робототехнической платформы возвращаться в одно и то же положение в каждый момент времени после ручного выравнивания изображения, можно легко наблюдать за клетками, экспрессирующими GFP, и легко визуализировать уникальные особенности этой системы слежения.

Как следует из этой анимации, клетки, экспрессирующие GFP, обведены кружком, клетка, обведенная красным цветом, показывает очень быстрое снижение экспрессии через 18-20 часов после бомбардировки, в то время как клетка, обведенная белым цветом, показывает замедленное начало экспрессии GFP. Помимо анимации, эта процедура позволяет быстро количественно оценить экспрессию GFP с течением времени в целевой ткани лимской фасоли. Эти репрезентативные результаты показывают сравнительную количественную оценку интенсивности промотора с использованием промотора CAMV 35 S и четырех различных промоторов сои.

Мы только что показали вам, как ввести ДНК в каталин прорастания. Семена лимской жилки помещают каталин на робота, собирают изображения для анализа изображений и анализируют эти изображения. Мы регулярно используем эту процедуру в нашей лаборатории для валидации промоторов клонов растений.

Можно получить большое количество данных от внедрения различных промоторов растений. Тем не менее, эта процедура сложна со многими этапами, которые могут пойти не так, когда при выполнении этой процедуры важно начать со свежих семян фасоли или, по крайней мере, использовать семена высокого качества, которые хранились должным образом. Также важно быстро получить крышку для резки bombard и установить ее на роботе, а также использовать толстую крышку для миски для домашних животных, чтобы свести к минимуму проблемы с конденсацией.

И, наконец, обратите внимание, что GFP, которую мы используем, - это другая версия под названием SGFP, front Gen HIN Lab в Гарвардском университете. Этот GFP не очень стабилен и может быть лучше для отслеживания быстрых изменений в экспрессии генов. И это то, что мы наблюдаем за нами.

И удачи в ваших экспериментах.