Name: Подготовка политенных хромосом Drosophila Кабачки для антител маркировки (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Узнайте метод приготовления политенных хромосом Drosophila для антител маркировки. Этот протокол включает культивирование личинок, диссекцию слюнных желез и фиксацию для микроскопии.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы благодарим г-жа В. Lephart для поддержания запасов летать Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения гранта (GM62916) и Национального научного фонда грант (MCB0817107).

Следующие протокол для подготовки сквош политенных хромосом адаптировано из процедуры, описанной в Йохансен и соавт. (2009). 1. Культура третьего возраста личинок дрозофилы Для того чтобы получить оптимальную политенных хромосом для высокого качества подготовки сквош, непереполненные условий культивирования необходимы (например, место около 20 откладывающих яйца самок мух в стандартный 4 "бутылку летать и изменения в новой бутылке каждый день). Выберите жирный лиц от первого урожая восхождения третьего возраста личинок, пока они еще блуждающие, но незадолго до окукливания. Мы регулярно культуры при 21 ° С, но 18 ° C даст толще хромосом, что может быть более подходящим для некоторых целей, таких как, например, когда группа / межзонных регионах должны быть визуализированы с высоким разрешением. 2. Политенных материалов сквош <ul><li> Драммонд рассечение щипцы (2) </li><li> Чашки Петри (60 х 15 мм) </li><li> Матовый предметные стекла (Fisher номер 12-544-3) (поли-лизин-покрытием) </li><li> 22 х 22 мм № 15 Покровные стекла (Fisher № 12-520B) (покрытый Sigmacote; Sigma # SL2) </li><li> 22 х 40 мм № 15 Покровные стекла (Fisher № 12-530B) </li><li> Ким-салфетки </li><li> Фазы контрастного микроскопа с 20-кратным цель </li><li> Малый Дьюара (например, термос или термос) </li><li> Длинные щипцы </li><li> Лезвия для бритвы </li><li> Коплин Jar </li><li> Резино-дева или Tupperware лоток (или эквивалент герметичные лоток) </li><li> Парафильмом (разрезать на квадраты 22 мм) </li><li> 175 г веса </li></ul> 3. Фиксаторы и решения <ol><li> 5X фондовом формальдегида. Подготовка свежего раствора на 0,74 g. параформальдегида в 4,0 мл дН 2 O и 28 мкл 1 N КОН. Нагреть до 65 ° С для растворения параформальдегида и затем хранить на льду. </li><li> Fixative 1. Подготовка свежий раствор по 0,5 мл 10 раз PBS, 50 мкл Тритон Х-100, 3,45 мл дН 2 O и 1,0 мл с 5-кратным фондовом формальдегида. Теплый разогнать Тритон Х-100 и использовать в течение 1 часа. </li><li> Fixative 2. Подготовка свежий раствор 1,5 мл дН 2 O, 2,5 мл ледяной уксусной кислоты и 1,0 мл с 5-кратным фондовом формальдегида и использовать в течение 1 часа. </li><li> Lactoacetic кислотный раствор. Приготовьте раствор по 1 мл молочной кислоты, 2 мл дН 2 O, и 3 мл уксусной кислоты. </li></ol> 4. Политенных хромосом сквош подготовки: <ol><li> Промыть личинок с водой и трансфер в PBS в блюдо культуры тканей для вскрытия. </li><li> Возьмитесь за кончик рта крючки с одной парой щипцов, удерживая тело на 2 / 3 пути вниз с другой парой, и тянут в рот крючки так слюнные железы подвергаются. Отдельные слюнных желез из мозга и глаз усиков диски, и рассекать от жира и любых других связанных с ними тканей железы. </li><li> Добавьте 200 мкл Fixative 1 до первой скважины из двух хорошо слайд депрессии и 200-300 мкл Fixative 2 до и два. Передача одной пары слюнных желез в период до 1 Fixative в хорошо одно и инкубировать в течение времени, необходимого для целевой эпитопа, обычно около 1-2 минут. (Примечание: некоторые эпитопы, например, для большинства модификаций гистонов, может потребоваться 5 минут или дольше фиксации.) </li><li> Использование щипцов передачи слюнных желез Fixative 2 в а 2 и инкубировать в течение двух минут. </li><li> Передача железы до 10-30 мкл Lactoacetic раствора кислоты на чистую Sigmacoted покровное. Осторожно опустите полилизином покрытие на стекло микроскопа покровное и без применения вертикального давления, забрать покровное так железы между горкой и покровное. Сразу способствовать лизису клеток и хромосомных распространения тщательно схватив покровное щипцами на одном краю и аккуратно перемещая его слегка назад и вперед, стараясь минимизировать любые вертикальные давление на ткани. Также можно использовать ластик стороне карандашом или даже пальцев, чтобы аккуратно двигаться покровное туда и обратно. Обратите внимание, что любая задержка в движении покровного вперед и назад, скорее всего, уменьшит распространение хромосомных оружия, так как они имеют тенденцию становиться более жесткой при воздействии Lactoacetic кислотный раствор. Помутнение раствора часто является хорошим показателем ячейки разделения. Осторожно нажав покровное наклонно (чтобы избежать вертикального давления) с резинкой стороне карандашом несколько раз, может также помочь в хромосомном распространения. </li><li> Сразу изучить ткани под микроскопом фазового контраста с 20 или 40Х целью определить, является ли хромосомы хорошо распространяться. </li><li> При хромосомных распространения достаточно, установить слайд с покровным стороной вниз на стопку чистой Ким-салфетки. Место второго Ким-протрите сверху и придавить хромосом, помещая большой палец над местом, где покровное позиционируется и нажав твердо, избегая любого горизонтального перемещения покровного стекла, что бы сдвигахромосом. </li><li> Изучить слайд снова под микроскопом, чтобы определить, если препарат подходит для намеченной цели. Если хромосом значительно продвинулись на выжимании, использовать меньше объема Lactoacetic раствора кислоты в последующих препаратов. Повторите шаги 4.1-4.8, пока достаточное количество подходящих слайды были получены. Место 175 г веса на покровное из слайдов. </li><li> Заполните небольшой сосуд Дьюара (например, термос) с жидким азотом. Используя длинный пинцет, окуните в жидкость слайд № 2 до остановки кипения, удалить слайд, и немедленно использовать краю чистым лезвием в одном углу, чтобы перевернуть с покровным. Если слайд будет использоваться сразу, место в банке Коплин с PBS при 4 ° C. В противном случае собирать слайд в банку Коплин заполнены 95% этанола. Изучить покровное раз мороз сублимированной прочь, чтобы подтвердить, что ткани придерживался слайд-шоу и не остался с покровным. Повторите с оставшейся слайды, пока все слайды хранятся либо в PBS (для использования в течение нескольких часов) или этанола (на более длительный срок хранения). </li></ol> Представитель Результаты Первым важным шагом для получения высокого качества политенных сквош препарата расти жирных личинок с большими ядрами слюнных желез. Второй хорошей техникой с распространением процедура, которая может потребоваться некоторая практика. Один совет для улучшения распространения успеха заключается в нахождении минимального объема lactoacetic раствора кислоты во время давя шаг. Это будет способствовать достаточное распространение хромосом, не создавая чрезмерной потокового силы, которые можно мыть хромосомы оружие прочь. Стоит также отметить, что любая задержка в движении покровного туда и обратно позволит снизить распространение хромосомных оружия, поскольку они становятся более жесткими при воздействии Lactoacetic кислотный раствор. Если все пойдет хорошо, не должно быть много и очень распространенная политенных хромосом. На рисунке 1 показан пример такой подготовки, дважды помечены маркером межзонных регионов в зеленом и с краситель, который окрашивает диапазонов регионов в синий цвет. Если недостаточное распространение получается, хромосом будет выглядеть как маленькие шарики, как показано на рисунке 2. С другой стороны, если слишком много распространение произошло, chomosomes будет слишком тонким и расширенные или в некоторых случаях раздроблена на мелкие кусочки, как показано на рисунке 3. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig1.jpg" alt="Рисунок 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 1"> Рисунок 1. Политенных сквош подготовке двойного меченные антитела к JIL-1 гистонов H3S10 киназы (в красном) и Hoechst (синий). <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig2.jpg" alt="Рисунок 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 2"> Рисунок 2. Политенных сквош с недостаточным распространением. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig3.jpg" alt="Рисунок 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 3"> Рисунок 3. Политенных сквоша со слишком большим распространением.

<ol><li>Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-mediated+transcription+at+active+loci+does+not+require+histone+H3S10+phosphorylation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila.</a> Development. 135, 2917-2925 (2008).</li>
<li>DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+GFP-fusion+proteins+on+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Dros.+Inf.+Serv%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes.</a> Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).</li>
<li>Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+transcription+and+epigenetic+chromatin+modification+in+Drosophila+polytene+chromosome+squash+preparations+using+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies.</a> Methods. 48, 387-397 (2009).</li>
</ol>

Включение уксусная и молочная кислоты в обычных протоколов фиксации сквош облегчает как разрешение межзонных и хромосомные руку распространения, но к сожалению, некоторые эпитопы не выживают этого лечения. Примером такого эпитопа является H3S10ph (Cai и соавт., 2008). После кислотной обработки также имеет тот недостаток, что он утоляет присущие флуоресценции GFP с метками белков, DiMario и соавт. (2006) недавно разработала формальдегида основе &quot;бескислотной сквош техники&quot;, которые позволяют д...

Подготовка политенных хромосом drosophila Кабачки для антител маркировки

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Дрозофилы уже давно любимые модельной системой для изучения взаимосвязи между структурой хроматина и регуляции генов в связи с цитологическим преимущества, которые дает гигантский слюнной железы политенных хромосом личинок третьего возраста. В этой ткани хромосом пройти много раундов репликации в отсутствие деления клеток что приводит к приблизительно 1000 экземпляров. ДНК остается выровнен после каждого цикла репликации в результате чего значительно увеличен хромосом, которые предоставляют уникальную возможность соотнести хроматина морфологии с локализацией специфических белков. Следовательно, наблюдается высокий уровень заинтересованности в определении эпигенетические модификации присутствует на различных генов и на разных этапах процесса транскрипции. Важным инструментом для таких исследований является маркировка политенных хромосом с антителами к фермента, фактора транскрипции, или модификации гистонов интересов. Это видео показывает протокол сквош техника, используемая в Йохансен лаборатории для подготовки политенных хромосом дрозофилы на антитела маркировки.

Это видео показывает протокол сквош техника, используемая в Йохансен лаборатории для подготовки<em&gt; Drosophila</em&gt; Политенных хромосом антитела маркировки.

Подготовка политенных хромосом Drosophila Кабачки для антител маркировки

Drosophila долгое время остается излюбленной модельной системой для изучения взаимосвязи между структурой хроматина и регуляцией экспрессии генов благодаря цитологическим...

Данная процедура начинается с культивирования личинок дрозофилы третьей стадии с жирным телом в пробирке для мух. С помощью двух пар пинцетов слюнные железы отделяют от личинок путем диссекции. Затем слюнные железы фиксируют в двух различных фиксаторах на предметном стекле с двумя лунками.Наконец, железы раздавливают в растворе лактоуксусной кислоты между покровным стеклом и предметным стеклом микроскопа. Здравствуйте, я доктор Кристен Йохансен с кафедры биохимии, биофизики и молекулярной биологии Университета штата Айова. Здравствуйте, я аспирант из лаборатории Йохансен.Сегодня мы продемонстрируем процедуру подготовки препаратов раздавов политенных хромосом дрозофилы, подходящих для антительного мечения. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения эпигенетических модификаций гистонов и их связи со структурой хроматина и экспрессией генов. Приступим к работе.Для получения оптимальных политенных хромосом для высококачественных препаратов из скваша необходимы условия культивирования без перенаселения. Поместите около 20 откладывающих яйца самок мух в стандартный четырехдюймовый флакон для мух и ежедневно пересаживайте их в новый флакон. Культивирование при 21 °C подходит для большинства целей, однако инкубация при 18 °C позволит получить более толстые хромосомы, которые могут быть более подходящими для некоторых экспериментов, например, когда требуется визуализация зон между полосками с высоким разрешением.Выберите наиболее упитанных особей из первой группы личинок третьего возраста, поднимающихся вверх. Пока они находятся в фазе активного перемещения, но непосредственно перед окукливанием, личинки хорошо видны на стенках флакона над кормом. С помощью пинцета перенесите личинок в чашку для культивирования тканей.Перед каждым раундом раздавливания промойте две или три личинки водой, после чего перенесите их в чистую чашку с PBS для препарирования. Раствор PBS должен полностью покрывать личинок, однако жестко ограничивать время выполнения этого этапа не требуется. Поскольку личинки могут выживать в таких условиях в течение нескольких часов, поместите чашку с личинками в PBS на предметный столик диссекционного микроскопа с помощью одного пинцета.Захватите кончики ротовых крючков, удерживая тело. Примерно на две трети ниже второй парой пинцетов потяните за ротовые крючки, чтобы обнажить слюнные железы. Отделите слюнные железы от мозга, глаза и тенальных дисков, затем удалите жировое тело и любые другие связанные с ними ткани.Добавьте 200 мкл фиксатора один в первую лунку предметного стекла с двумя лунками и от 200 до 300 мкл фиксатора два во вторую лунку. С помощью пинцета переносите по одной паре слюнных желез в фиксатор один в первую лунку и инкубируйте в течение времени, необходимого для целевого эпитопа, обычно от одной до двух минут.Перенесите слюнные железы в лунку 2 для фиксации и инкубируйте в течение 2 минут. С помощью пинцета перенесите железы на чистый покровное стекло с сигма-покрытием, содержащее от 10 до 30 µL свежеприготовленного раствора лакто-уксусной кислоты. Осторожно опустите предметное стекло с полилизин-покрытием на покровное стекло.Осторожно поднимите предметное стекло, используя адгезию жидкости к стеклу, чтобы захватить покровное стекло, не оказывая вертикального давления. Чтобы хромосомы в препарате сразу же распределились, аккуратно захватите край покровного стекла пинцетом и осторожно подвигайте его немного вперед и назад. Снова минимизируя вертикальное давление на ткань, совершайте такие покачивания покровного стекла, что крайне важно для адекватного разделения отдельных клеток слюнной железы.Осторожное касание покровного стекла под углом ластиком карандаша также может помочь в распределении материала; помутнение раствора часто служит хорошим индикатором разделения клеток. Незамедлительно изучите ткань под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться, что хромосомы хорошо распределены, о чем свидетельствуют четко разделенные и вытянутые плечи хромосом. Если при первой попытке хромосомы не распределились достаточно хорошо.При необходимости можно повторить осторожное постукивание по покровному стеклу до тех пор, пока не будет достигнуто достаточное растекание. Положите предметное стекло стороной с покровным стеклом вниз на стопку чистых салфеток Kim wipes. Сверху на препарат положите чистую салфетку.Приложите большой палец к покровному стеклу и с усилием нажмите строго вертикально вниз. Избегайте горизонтальных движений, которые могут привести к сдвигу хромосом. Снова осмотрите препарат под микроскопом, чтобы определить его пригодность для текущего эксперимента.Повторите процедуру диссекции и приготовления раздавливаемых препаратов хромосом, чтобы получить достаточное количество предметных стекол. С помощью длинного пинцета поместите груз массой 175 gram на покровное стекло каждого препарата. Окуните подготовленное предметное стекло в небольшой объем жидкого азота и удерживайте его там до прекращения кипения.Извлеките предметное стекло и немедленно подденьте край покровного стекла чистым лезвием бритвы, чтобы отделить его. Поместите предметное стекло в копланарную банку, заполненную холодным PBS для немедленного использования или 95% ethanol для длительного хранения. После того как иней сублимирует, осмотрите покровное стекло, чтобы убедиться, что ткань осталась на предметном стекле.Первым критически важным этапом для получения качественных препаратов раздавливания (squash-препаратов) INE является выращивание крупных личинок с большими ядрами слюнных желез. Вторым этапом является отработка техники процедуры распределения материала, что может потребовать определенной практики. Одним из способов повышения эффективности распределения является подбор минимального объема раствора лактоацетильной кислоты на этапе раздавливания.Это обеспечит достаточное распластывание хромосом, не создавая при этом избыточных сил потока, которые могут привести к смыванию плеч хромосом. Также следует отметить, что любое промедление при перемещении покровного стекла вперед-назад приведет к уменьшению распластывания плеч хромосом, так как при воздействии раствора лактоуксусной кислоты они становятся более жесткими. При правильном выполнении процедуры на каждом предметном стекле должно получиться большое количество хорошо распластанных политенных хромосом.Здесь мы приводим пример такого препарата с двойным мечением: маркером для межполосных участков красного цвета и красителем, который окрашивает полосчатые участки в синий цвет. Если распластывание недостаточно, хромосомы будут выглядеть как маленькие шарики, как показано здесь. С другой стороны, при чрезмерном распластывании хромосомы будут слишком тонкими и вытянутыми или, в некоторых случаях, фрагментированными на мелкие части, как показано здесь.Таким образом, мы продемонстрировали вам способ приготовления препарата расплющивания политенных хромосом дрозофилы. При выполнении этой процедуры важно помнить, что начинать следует с живых личинок. На этом всё.Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.

preparation-drosophila-polytene-chromosome-squashes-for-antibody

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Способы выделения и подготовки дрозофилы яичек образцов (жить и фиксированной) для работы с изображениями на фазе контраста и флуоресцентной микроскопии описаны здесь.

Цитологического анализа сперматогенеза: Живые и Исправлены Препараты<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Семенники

Хромосомная живопись является полезным методом для изучения организации ядра клетки и эволюции кариотипа. Здесь мы демонстрируем подход к изоляции и усилению определенных областей интереса от одиночных политеных хромосом, которые впоследствии используются для двух- и трехмерной флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

2D и 3D хромосомная живопись у малярийных комаров

Здесь мы представляем простой метод проведения флуоресцентной гибридизации ДНК in situ (DNA ISH) для визуализации повторяющихся гетерохроматических последовательностей на хромосомах, установленных на слайде. Метод требует минимального количества реагентов и универсален для использования с короткими или длинными зондами, различными тканями, а также для детектирования с помощью флуоресцентных или нефлуоресцентных сигналов.

Простой метод ДНК флуоресценции<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация, чтобы раздавил хромосом

Этот протокол описывает, как создать клеточную линию Drosophila S2, чувствительную к низкомолекулярным ингибиторам кинезина-5. Также описывается использование этих клеток в клеточном анализе коррекции ошибок.

Создание &quot;гуманизированные&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 клеточной линии Чувствительные к фармакологическим ингибирование Kinesin-5

Мы представляем протоколы сбора, подготовки и визуализации зрелых ооцитов дрозофилы. Эти методы позволяют визуализировать поведение хромосом, сборку и функционирование веретена во время мейоза.

Методы для работы с изображениями прометафазе и метафазе мейоза I в фиксированных<em&gt; Drosophila</em&gt; ооциты

Ядерные поверхностные спреды являются незаменимым инструментом для изучения хромосомных событий во время мейоза. Здесь мы демонстрируем метод подготовки и визуализации мейотических хромосом во время профазы I из сперматозитов зебры.

Приготовление Мейотических хромосомных спредов из сперматозоидов зебрафиш

Этот протокол направлен на визуализацию агрегатов гетерохроматина в клетках Drosophila polytene.

Иммунофлуоресцентное окрашивание для визуализации гетерохроматиновых ассоциированных белков в слюнных железах дрозофилы

Этот протокол описывает индивидуальную флуоресцентную мечение на основе антител и инъекцию в ранние эмбрионы дрозофилы , чтобы обеспечить живую визуализацию белков с низкой распространенностью или посттрансляционных модификаций, которые трудно обнаружить с помощью традиционных подходов GFP/mCherry-tag.

Визуализация белков с низкой распространенностью и посттрансляционных модификаций в живых эмбрионах дрозофилы с помощью инъекции флуоресцентных антител

В этом исследовании представлен упрощенный протокол обработки тканей, включающий обезглавливание, фиксацию, криосекцию, флуоресцентное окрашивание, иммуноокрашивание и визуализацию, который может быть расширен до конфокальной и многофотонной визуализации. Метод сохраняет эффективность, сравнимую со сложными вскрытиями, минуя необходимость в продвинутых моторных навыках. Количественный анализ изображений обеспечивает широкие исследовательские возможности.

Прямая криосекция голов дрозофил для усиленного флуоресцентного окрашивания мозга и иммуноокрашивания

В этом исследовании мы разработали подробный протокол для бесконтактного мечения (PL) на основе TurboID в яичниках D. melanogaster , охватывающий этапы от приема добавок биотина и рассечения яичников до валидации экспрессии трансгенов и обогащения биотинилированных пептидов для масс-спектрометрии.

В естественных условиях Применение бесконтактного мечения на основе TurboID у Drosophila melanogaster

В этой статье описывается эффективный протокол воображаемой диссекции диска и окрашивания антител, который экономичен с использованием реагентов и облегчает работу с воображаемыми дисками в небольших количествах.

Мелкомасштабная диссекция и окрашивание антителами глазно-усиков и крыльев (Drosophila melanogaster)

Узнайте метод приготовления политенных хромосом Drosophila для антител маркировки. Этот протокол включает культивирование личинок, диссекцию слюнных желез и фиксацию для микроскопии.

Подготовка политенных хромосом Drosophila Кабачки для антител маркировки

Больше видео