Кристофер Хьюз: в пробирке модель для изучения ангиогенеза (Интервью)

Здравствуйте, меня зовут доктор Кристофер Хьюз. Я профессор Калифорнийского университета в Ирвине, и моя лаборатория занимается ангиогенезом. И нас особенно интересуют гены, которые регулируют процесс ангиогенеза.

Мы оптимизировали анализ in vitro на основе работы Нельсона, и в этом анализе мы можем рассмотреть все различные процессы, происходящие во время ангиогенеза, мы покрываем гранулы тедекса, маленькие бусины эндотелиальными клетками. Затем мы встраиваем их в фибриновые гели. Мы обеспечиваем факторы роста.

И в течение нескольких дней эндотелиальные клетки прорастают из бусин. Они мигрируют, выравниваются, размножаются, образуют трубки, ветвятся и образуют анастомоз. Так что примерно через 10 дней у нас есть полный капилляр, подобный сетевому в культуре.

Ну, некоторые из проблем с анализами envivo и ангиогенеза, например, те, которые проводятся на мышах, заключаются в том, что это не очень просто манипулировать системой. Трудно представить, когда это происходит внутри животного, вы не можете увидеть, как происходит ангиогенез. И если вы хотите манипулировать системой в наших культурах in vitro, очень легко генетически манипулировать эндотелиальными клетками, включать и выключать гены, и посмотреть на влияние этого на прорастающий ангиогенез.

И это гораздо сложнее сделать на всем животном. Вы должны делать нокауты или нокауты. Итак, это два основных преимущества.

Им легко манипулировать И его легко визуализировать. Таким образом, на протяжении многих лет было разработано множество различных анализов агенезии in vitro, и все они имеют свои преимущества и недостатки. В частности, хорошо известен анализ матриксного геля, при котором эндотелиальные клетки размещаются поверх этого внеклеточного матрикса, называемого матригелем.

Проблема в том, что эндотелиальные клетки создают структуры, похожие на шнуры, но они никогда не создают полноценных алюминизированных сосудов. Вы не видите прорастания, вы не видите анастомоза. Есть модели коллагеновых гелей, которые могут быть хорошими.

Есть много таких, в которых Вы не видите разрастания эндотелиальных клеток. Вы не склонны видеть анастомоз. Разработанный нами анализ фибринового геля основан на модели Нельсона Кара, опубликованной в середине девяностых годов.

И теперь мы значительно улучшили это, так что можем видеть все стадии ангиогенеза. Мы можем наблюдать за начальным прорастанием, миграцией. Мы видим пролиферацию клеток, мы видим образование просвета, мы получаем ветвление и, наконец, получаем анастомоз для формирования полной сосудистой сети in vitro.

Так что мы считаем, что этот анализ действительно является лучшей системой in vitro, если вы хотите рассмотреть все эти различные стадии ангиогенеза. Еще одно преимущество этого анализа in vitro заключается в том, что мы можем проводить лазерный захват, микродиссекцию, мы можем вращать культуру так, чтобы она стала очень плоской, а затем использовать микродиссекционный микроскоп с лазерным захватом. На самом деле мы можем исключить отдельные клетки, в частности, нас интересуют концевые клетки.

И поэтому мы отсекаем их, и мы можем посмотреть на экспрессию генов, особенно в клетках кончика по сравнению с клетками ствола, клетками, которые на самом деле производят просвет. И наша гипотеза заключается в том, что между этими двумя популяциями клеток будет наблюдаться дифференциальная экспрессия генов. Мы можем посмотреть на это, это было бы практически невозможно сделать в системе in vivo.

Так что мы считаем, что это еще одно важное преимущество использования этого анализа in vitro. В ранних работах, которые были проделаны в этой области, как я уже упоминал Нельсон Рекон, использовались микрососудистые эндотелиальные клетки. И есть много мнений о том, что микрососудистые эндотелиальные клетки, клетки, которые вы хотели бы использовать для такого анализа, потому что in vivo именно микрососудистая ЭК действительно формирует новые сосуды.

Мы решили попробовать сделать это с помощью ve. Это эндотелиальные клетки пупочной вены человека по нескольким причинам. Одним из них является то, что эти элементы очень легко получить.

Вы можете обратиться в больницу, вы можете получить пуповину из родильных отделений, и вы можете очень легко изолировать клетки. А также эти клетки уже много лет используются в культуре. Они очень хорошо охарактеризованы.

Итак, мы настроили этот анализ и оптимизировали его так, чтобы мы могли использовать эти клетки по этим причинам. И что интересно, оказывается, что эти эндотелиальные клетки крупных сосудов, по-видимому, принимают форму микрососудистых эндотелиальных клеток и культур. Они теряют много генов, которые в норме экспрессируются крупными сосудами ec, и начинают экспрессировать гены, которые в норме связаны с микрососудистыми эндотелиальными клетками.

И они прекрасно способны образовывать капиллярные ростки, делать просветы и делать то, что во всем мире выглядит как настоящие капилляры в культуре. Так что они просты в использовании, они просты в использовании, и они делают то, что мы хотим, чтобы они делали. Они прорастают и, и из них получаются правильные алюминированные сосуды.

Когда мы хотим количественно оценить этот анализ, у нас есть несколько способов. Мы можем смотреть на действительно количественные критерии, такие как количество ростков, длина ростков, диаметр ростков, количество точек ветвления, количество анастомоза, но мы также смотрим на качественные критерии. Итак, мы можем посмотреть, образуют ли они просветы?

И это, вероятно, то, что нас интересует больше всего. Во многих анализах, которые мы проводим, мы проверяем правильное формирование просвета. И это действительно скорее качественная оценка, хотя по мере того, как сосуды становятся больше, можно измерить и диаметр этих люменов.

Поэтому мы используем фибробласты в этих культурах. Мы встраиваем шарики в фибриновый гель и наносим фибробласты поверх геля. Фибробласты абсолютно необходимы для правильного прорастания и формирования просвета.

При отсутствии фибробластов мы получаем некоторое прорастание. Тем не менее, эндотелиальные клетки, как правило, не остаются прикрепленными друг к другу. Что происходит, так это то, что они мигрируют друг от друга.

И поэтому любая структура, которую вы разрабатываете на этом ростке, имеет тенденцию разваливаться. А через несколько дней эндотелиальные клетки подвергаются апоптозу. Таким образом, похоже, что фибробласты вырабатывают факторы, которые необходимы для ангиогенеза, по крайней мере, в этой системе in vitro.

И нам было очень интересно узнать, что это за факторы. Мы обнаружили, что фибробласты выделяют что-то в среду, поэтому мы можем взять кондиционную среду из фибробластов, и это будет способствовать правильному прорастанию и формированию просвета. Так что мы определенно имеем дело с растворимым фактором.

Очевидно, что нам очень интересно узнать, что именно производят фибробласты, что так важно для ангиогенеза в этой системе. Мы перепробовали все обычные подозреваемые, VEGF, основные fg F есть, есть в культуре, добавление большего количества не заменяет фибробласты. Мы также пробовали ангиопоэтин 1, TGF beta, H, GF, и так далее, и так далее.

Пока мы не нашли жизненно важного фактора. Итак, то, что мы сейчас делаем, — это очистка факторов от фибробластов в среде заболевания. Итак, мы помещаем среду условия на различные столбцы, катионы, обмены, исключения размера, и получаем доли из них, которые обладают активностью.

И теперь мы следим за этой активностью, берем эти дроби, находим, какие из них активны, и оттуда мы можем запустить их на гелях, убедиться, что у нас есть всего лишь относительно небольшое количество полос на геле, а затем мы можем вырезать их и упорядочить их по масс-спектрометрии. И это дает нам много интересных дней. Сейчас у нас есть довольно много генов-кандидатов, которые мы тестируем по отдельности, чтобы увидеть, являются ли они на самом деле тем фактором, который мы ищем.

Итак, мы проверили множество известных ангиогенных факторов и знаем, что растительные GF и основные FGF на самом деле необходимы для правильного прорастания в этом анализе. Но это еще не вся история. Есть производные факторы, которые важны, поскольку, как я уже упоминал, мы взяли опухолевые клетки, которые обладают высокой ангиогенной способностью in vivo, они генерируют большие опухоли у мышей и сильно васкуляризированы.

Мы рассмотрели эти опухолевые клетки, и они экспрессируют очень высокие уровни vegf, и мы поместили их в наши культуры. Таким образом, мы заменили фибробласты этими опухолевыми клетками, и они не поддерживают надежный ангиогенез в этом анализе. И это, это очень интересно.

Это говорит о том, что существует перекрестная связь между опухолью, S-стромой, которая представляет собой фибробласты и другие поддерживающие клетки в ткани, и эндотелиальными клетками. И вполне может быть, что опухолевые клетки производят некоторые факторы, которые работают непосредственно на эндотелиальные клетки, но они также производят другие, которые стимулируют фибробласты и другие стромальные клетки для выработки факторов, которые затем также поддерживают надежный ангиогенез.