Разбор и культуры спаечный Нейроны из эмбриональных спинного мозга

В этом видео демонстрируется метод препарирования и культивирования комм-хоральных нейронов из эмбрионального спинного мозга. Процедура начинается с забора эмбрионов крыс Е 13, а затем рассечения спинного мозга. Во время вскрытия спинной мозг вскрывается вдоль крышной пластины и подготавливается в конфигурации открытой книги.

Полоски тыльной ткани рассекаются и собираются в пробирку. Дорсальная ткань диссоциируется на одноклеточную суспензию под действием трипсина и механического разрушения. Затем комиссуральные нейроны культивируют на стеклянных крышках с полилизиновым покрытием или чашках для культивирования тканей.

Затем они могут быть использованы для изучения клеточных и молекулярных механизмов роста и ориентации аксонов. Здравствуйте, меня зовут Себастьян из Лаборатории молекулярной биологии развития нейронов в Институте клинических исследований Монреаля. Здравствуйте, меня зовут Стив Моэн, я тоже из Лаборатории молекулярной биологии нейронного развития.

Сегодня мы покажем вам процедуру рассечения и культивирования комиссуральных нейронов эмбрионального спинного мозга. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения клеточных и молекулярных механизмов акцентного руководства. Итак, приступим.

Сегодня спинной мозг будет препарирован из свежесобранных эмбрионов крыс Е 13, помещенных в чашку со средой L 15 на протяжении всего вскрытия. Важно держать эмбрионы и растворы на льду. Помните, что на всех этапах рассечения крайне важно не растягивать спинной мозг никелем, так как это может препятствовать изоляции полностью неповрежденного спинного мозга.

Под вскрытием микроскопа отделите эмбрион от всех лишних эмбриональных тканей и эмбриональных оболочек. Затем поместите один эмбрион в чашку для вскрытия. С помощью микроножниц отрежьте голову и задние части показанных здесь углов.

Это позволит создать ровную поверхность, которая поможет расположить эмбрион для легкого доступа к спинному мозгу. Расположите эмбрион вентральной стороной вниз так, чтобы передняя сторона была направлена в сторону. С помощью щипцов прочно прижмите эмбрион с одной стороны.

Не зажимайте и не отпускайте щипцы, иначе ткань порвется вместе со второй парой щипцов. Захватите кожу сбоку от спинного мозга. Зажмите кончики удерживающих щипцов.

Снимите кожу, покрывающую заднюю часть эмбриона, чтобы обнажить спинной мозг, обернутый в его мозговые оболочки, чтобы частично отделить ткань справа от спинного мозга. С помощью закрытых щипцов протыкайте ткань, начиная с уровня удерживающих щипцов. Подойдите как можно ближе к спинному мозгу, не касаясь его.

Повторите несколько раз вдоль спинного мозга. Это приведет к прикреплению некоторых ганглиев дорсальных корешков и нарушению вентральных органов. Оставьте немного ткани прикрепленной на переднем и заднем концах, начиная с переднего конца.

С помощью вольфрамовой иглы в форме крючка разрежьте мозговые оболочки и вскройте спинной мозг вдоль крышной пластины. Поверните эмбрион на 180 градусов и нарушьте ткань с оставшейся стороны. Используя тот же метод.

Затем полностью отделяют ткани с левой стороны спинного мозга, ту сторону, которая была нарушена ранее изначально на правой, размещают спинной мозг на его боку и с помощью щипцов удаляют большую часть оставшейся мезенхимальной ткани и ганглиев дорсальных корешков. С помощью щипцов вскройте короткий лоскут мозговых оболочек. На этом этапе мозговые оболочки и спинной мозг представляют собой два листа сэндвич-ткани.

Используйте щипцы, чтобы прижать большую часть спинного мозга на переднем конце. Обхватите два разделенных сегмента щипцами и снимите мозговые оболочки. При плавном постоянном движении неравномерное шелушение может нарушить слой мозговых оболочек и/или спинной мозг.

Если слой мозговых оболочек разрывается во время растяжения, часть спинного мозга, которая остается прикрепленной к мозговым оболочкам, обычно не подлежит восстановлению. Хотя иногда это возможно. С помощью пластиковой трубки осторожно перенесите изолированный спинной мозг в чашку со средой L 15 с 10% термоинактивированной лошадиной сывороткой на лед перед обработкой большего количества эмбрионов.

Не забудьте заменить среду в чашке для препарирования охлажденным L 15, чтобы сохранить эмбрион прохладным и сохранить целостность тканей. Соберите спинной мозг у всех эмбрионов, прежде чем приступать к вскрытию спинного мозга. Чтобы начать расслоение спинного мозга, поместите один только что изолированный спинной мозг в чашку Петри, содержащую L 15 с 10% теплом и активированную лошадиную сыворотку.

Отрежьте более широкую переднюю часть, которая включает в себя часть заднего мозга. Затем положите спинной мозг ровно и разложите, как раскрытую книгу. Дорсальная ткань располагается в самых боковых частях открытой книги спинного мозга, при этом прикалывание спинного мозга прямой вольфрамовой иглой с помощью L-образной вольфрамовой иглы вырезает полоску примерно на одну пятую, ширина одной половины спинного мозга при разрезании более широких полос увеличит выход, но снизит чистоту культуры.

Переложите несколько спинных полосок в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую среду L 15 с 10% лошадиной сывороткой, и поместите пробирку на лед. Остальная часть процедуры будет проходить рядом или внутри капюшона для культуры тканей. Для этих культур важно заранее подготовить растворы и оборудование, обычно перед вскрытием.

На этапе татирования используются отполированные огнем трубки для пасты двух размеров, один диаметра, который в два раза меньше первоначального размера, а другой немного меньше. Перед началом работы покройте две отполированные огнем трубки сывороткой, содержащей среду, путем аспирации среды в трубы и оставления на 30 секунд. Это уменьшит количество ячеек, которые прилипают к стеклу во время работы.

Начните с проверки того, что тыльные полоски осели на дно трубки. Под капюшоном для протекания пластинки удалите большую часть натанта SUP с помощью простой пасты для каждого питомца. Быстро вымойте с тремя миллилитрами холодного магния и HBSS, не содержащего кальция.

Дайте полоске тыльной нервной трубки отстояться в течение двух минут. Затем удалите HBSS вместе с пастой. Доведите объем до 4,7 миллилитров.

С теплым HBSS добавьте 0,3 миллилитра 2,5% трипсина, чтобы получить конечную концентрацию 0,15% триина, и аккуратно перемешайте, выдерживайте на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение семи минут. Осторожно перемешайте один раз в середине инкубации. Как только инкубация закончится, добавьте ДНК для конечной концентрации 150 единиц на миллилитр в сульфат магния для конечной концентрации 0,15% и быстро перемешайте.

Теперь дорсальные участки нервной трубки должны быть фрагментированы. Центрифугируйте фрагменты ткани при 200 G в течение четырех минут. Удалите надосадочную жидкость SUP с помощью пасты перпе, оставив на дне тюбика от 50 до 100 микролитров жидкости.

Осторожно переверните трубку, чтобы ослабить гранулу. Затем промойте клетки, добавив пять миллилитров теплого HBSS. Дайте клеткам отстояться при комнатной температуре в течение двух минут.

Открутите вниз и снова промойте ячейки. На этот раз резус суспензирует в двух миллилитрах теплого HBSS. Используйте пипетку для огненной полировки половинного диаметра, чтобы растирать клетки, медленно пипетируя вверх и вниз от четырех до шести раз, направляйте жидкость к стенке пробирки, чтобы разбить более крупные комки и уменьшить гибель клеток.

Избегайте образования пузырей и не переедайте. Используйте самую маленькую пасту из стекла для огнеупорной полировки для дальнейшей диссоциации клеток, медленно пипетируя вверх и вниз три-четыре раза таким же образом. Нет необходимости диссоциировать все клеточные сгустки, так как агрегаты имеют тенденцию образовывать мертвые клетки в мусоре.

Дайте любым фрагментам тканей осесть в течение одной минуты. Затем удаляют 20 микролитров натанта SUP, который должен содержать взвешенные клетки для подсчета в гемосотере, нейроны должны быть жизнеспособны не менее чем на 95% по триану синей ионной пластине. Нейроны в нейробазальных средах в концентрации, подходящей для вашего применения.

Через 16–18 часов смените среду на нейронную базальную питательную среду, чтобы избежать смещения. Нейроны мягко удаляют среду с помощью пипетки, а не аспирируют с помощью вакуумного насоса. Вот некоторые репрезентативные результаты изолированных комиссуральных нейронов, покрытых стеклянными покровными стеклами с покрытием PLL через четыре часа после того, как нейроны покрытия прилипли к поверхности через 30 часов после покрытия.

Большинство нейронов имеют расширенные аксоны с видимым конусом роста. Эти нейроны могут быть легко использованы в экспериментах по иммунофлуоресценции. В этом примере микротрубочки помечены зеленым цветом, актон — красным, а NA — синим.

Мы только что показали вам, как препарировать и культивировать комиссуральные нейроны из эмбрионального спинного мозга. При выполнении этой процедуры важно помнить, что чистота комиссуральных нейронов зависит от толщины дорсальной полосы, которая рассекается. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.