Разбор и культуры спаечный Нейроны из эмбриональных спинного мозга
25 мая 2010 г.
Это видео демонстрирует метод препарировать и культуры спаечный нейроны от E13 крысы спинной спинного мозга. Расхождение между спаечный нейроны полезно изучать клеточные и молекулярные механизмы роста аксонов и руководство.
В данном видео демонстрируется метод выделения и культивирования хореоидных нейронов из эмбрионального спинного мозга. Процедура начинается со сбора эмбрионов крыс на стадии E 13 с последующим выделением спинного мозга. В ходе диссекции спинной мозг вскрывается вдоль крышной пластинки и подготавливается в конфигурации «открытой книги».
Стрипы дорсальной ткани вырезают и собирают в пробирку. Дорсальная ткань диссоциируется до состояния суспензии одиночных клеток с помощью трипсина и механического разрушения. Затем комиссуральные нейроны культивируют на стеклянных покровных стеклах, покрытых полилизином, или в чашках для культивирования тканей.
Затем их можно использовать для изучения клеточных и молекулярных механизмов роста и наведения аксонов. Здравствуйте, я Себастьян из Лаборатории молекулярной биологии нейронного развития при Монреальском институте клинических исследований. Здравствуйте, я Стив Моэн, также из Лаборатории молекулярной биологии нейронного развития.
Сегодня мы продемонстрируем процедуру выделения и культивирования комиссуральных нейронов из спинного мозга эмбриона. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения клеточных и молекулярных механизмов аксонального наведения. Итак, приступим.
Сегодня будет проведено выделение спинного мозга из свежеполученных эмбрионов крыс на стадии E 13, которые в течение всего процесса препарирования будут находиться в чашке с средой L 15. Важно хранить эмбрионы и растворы на льду. Помните, что на всех этапах препарирования крайне важно избегать чрезмерного растяжения спинного мозга, так как это может помешать выделению полностью интактного препарата.
Под диссекционным микроскопом отделите эмбрион от всех внезародышевых тканей и эмбриональных оболочек. Затем поместите один эмбрион в чашку для диссекции. С помощью микроножниц отсеките голову и задние части под углами, показанными здесь.
Это создаст плоскую поверхность, которая поможет расположить эмбрион таким образом, чтобы обеспечить легкий доступ к спинному мозгу. Поместите эмбрион брюшной стороной вниз, передним концом вперед. С помощью пинцета надежно зафиксируйте эмбрион с одной стороны.
Не сжимайте и не отпускайте пинцет, иначе ткань разорвется в месте захвата вторым пинцетом. Захватите кожу сбоку от спинного мозга. Разведите кончики фиксирующих пинцетов.
Аккуратно удалите кожу со спинной стороны эмбриона, чтобы обнажить спинной мозг в мозговых оболочках, и частично отделите ткани справа от спинного мозга. Используя закрытый пинцет, раздвиньте ткани, начиная с уровня фиксирующего пинцета. Постарайтесь максимально приблизиться к спинному мозгу, не касаясь его.
Повторите эту операцию несколько раз вдоль спинного мозга. Это позволит закрепить некоторые ганглии задних корешков и разрушить вентральные органы. Оставьте немного ткани в переднем и заднем концах, начиная с переднего конца.
С помощью вольфрамовой иглы с крючком на конце рассеките мозговые оболочки и откройте спинной мозг вдоль крышной пластинки. Поверните эмбрион на 180 градусов и тем же способом удалите ткани с противоположной стороны.
Затем полностью отделите ткани с левой стороны спинного мозга (той стороны, которая была повреждена ранее справа); положите спинной мозг на бок и с помощью пинцета удалите большую часть оставшейся мезенхимальной ткани и ганглии спинномозговых нервов. Используя пинцет, приоткройте небольшой лоскут мозговых оболочек. На данном этапе мозговые оболочки и спинной мозг представляют собой две слоя ткани, расположенные друг над другом, подобно сэндвичу.
С помощью пинцета зафиксируйте большую часть спинного мозга с переднего конца. Захватите два разделенных сегмента пинцетом и отделите мозговые оболочки. Движение должно быть плавным и равномерным, так как при прерывистом отделении может произойти разрыв слоя оболочек или самого спинного мозга.
Если слой мозговых оболочек разрывается при вытягивании, часть спинного мозга, остающаяся прикрепленной к оболочкам, обычно не подлежит восстановлению, хотя иногда это оказывается возможным. Используйте пластический дозатор, чтобы аккуратно перенести изолированный спинной мозг в чашку с средой L 15 и 10% термоинактивированной сывороткой лошади на льду перед обработкой остальных эмбрионов.
Не забудьте заменить среду в диссекционной чашке на охлажденный L 15, чтобы поддерживать низкую температуру эмбриона и помочь сохранить целостность тканей. Извлеките спинные мозги из всех эмбрионов, прежде чем переходить к диссекции дорсальной части спинного мозга. Для начала диссекции дорсальной части поместите один свежеизвлеченный спинной мозг в чашку Петри, содержащую L 15 с 10% термоинактивированной сыворотки лошади.
Отрежьте более широкую переднюю часть, включающую часть заднего мозга. Затем разложите спинной мозг на плоскости и раскройте его, как книгу. Дорсальная ткань находится в самых латеральных частях раскрытого спинного мозга; зафиксируйте мозг прямой вольфрамовой иглой, а затем с помощью Г-образной вольфрамовой иглы вырежьте полоску шириной примерно в одну пятую от ширины одной половины спинного мозга; вырезание более широких полосок увеличит выход, но снизит чистоту культуры.
Перенесите несколько дорсальных полосок в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую среду L 15 с 10% сыворотки лошади, и поместите пробирку на лед. Остальная часть процедуры будет проводиться рядом с ламинарным шкафом для культивирования тканей или внутри него. Для данных культур важно заранее подготовить растворы и оборудование, как правило, еще до начала диссекции.
На этапе подготовки используются две стеклянные капилляры из паста-стекла, оплавленные на огне: одна имеет диаметр, равный половине исходного размера, а вторая — чуть меньший диаметр. Перед началом работы покройте обе оплавленные трубки средой, содержащей сыворотку, аспирировав среду в трубки и оставив их на 30 секунд. Это позволит уменьшить количество клеток, прилипающих к стеклу во время проведения процедуры.
Сначала убедитесь, что дорсальные полоски осели на дно пробирки. В ламинарном шкафу удалите большую часть супернатанта с помощью пипетки с наконечником. Быстро промойте три миллилитрами холодного HBSS без магния и кальция.
Дайте полоске дорсальной части нейральной трубки осесть в течение двух минут. Затем удалите HBSS с помощью пипетки. Доведите объем до 4.7 milliliters.
Используя теплый HBSS, добавьте 0,3 мл 2,5% трипсина до конечной концентрации 0,15% трипсина и осторожно перемешайте; инкубируйте на водяной бане при 37 °C в течение семи минут. Один раз осторожно перемешайте раствор в середине периода инкубации. По завершении инкубации добавьте ДНКазу до конечной концентрации 150 ед/мл и сульфат магния до конечной концентрации 0,15%, после чего кратковременно перемешайте.
Теперь срезы дорсальной части нейральной трубки должны быть фрагментированы. Центрифугируйте фрагменты ткани при 200 G в течение четырех минут. Удалите супернатант с помощью пипетки, оставив около 50–100 мкл жидкости на дне пробирки.
Осторожно встряхните пробирку, чтобы разрыхлить осадок. Затем промойте клетки, добавив 5 мл подогретого HBSS. Оставьте клетки отстояться при комнатной температуре в течение двух минут.
Центрифугируйте и снова промойте клетки. На этот раз ресуспендируйте их в двух миллилитрах теплого HBSS. Используя пипетку с огнеполированной końcówкой (диаметром в два раза меньше стандартной), тритурируйте клетки, медленно перенося их из части в часть четыре-шесть раз; направляйте струю жидкости на стенку пробирки, чтобы разбить крупные агрегаты и снизить гибель клеток.
Избегайте образования пузырьков и не перевзбивайте суспензию. Используйте пастеровскую пипетку из огнеполированного стекла с минимальным диаметром кончика, чтобы дополнительно диссоциировать клетки, медленно прокачивая их вверх и вниз три-четыре раза тем же способом. Нет необходимости полностью диссоциировать все клеточные конгломераты, так как из погибших клеток и клеточного дебриса имеют тенденцию образовываться агрегаты.
Дайте фрагментам ткани осесть в течение одной минуты. Затем отберите 20 µL супернатанта, который должен содержать суспендированные клетки для подсчета в гемоцитометре; жизнеспособность нейронов по методу окрашивания трипановым синим должна составлять не менее 95%. Нейроны в среде Neurobasal для посева должны быть в концентрации, соответствующей целям вашего исследования.
Через 16–18 часов замените среду на нейральную базальную среду для роста, чтобы избежать открепления клеток. Осторожно удалите среду с нейронами с помощью пипетки, не используя вакуумный аспиратор. Ниже представлены репрезентативные результаты изолированных комиссуральных нейронов, высеянных на стеклянные покровные стекла с PLL-покрытием: через четыре часа после посева и через 30 часов после посева, когда нейроны прикрепились к поверхности.
Большинство нейронов имеют удлиненные аксоны с выраженным конусом роста. Такие нейроны удобно использовать в экспериментах по иммунофлуоресценции. В данном примере микротрубочки окрашены зеленым цветом, актин — красным, а NA — синим.
Мы только что продемонстрировали вам, как выделить и культивировать комиссуральные нейроны из спинного мозга эмбриона. При выполнении этой процедуры важно помнить, что чистота популяции комиссуральных нейронов зависит от толщины выделяемой дорсальной полоски. На этом все.
Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном видео демонстрируется метод выделения и культивирования комиссуральных нейронов из дорсальной части спинного мозга крыс на стадии эмбрионального развития E13. Диссоциированные комиссуральные нейроны полезны для изучения клеточных и молекулярных механизмов роста и наведения аксонов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биология развития
Теоретические основы
- Коммиссуральные нейроны играют важнейшую роль в развитии нервной системы.
- Понимание механизмов их роста и навигации необходимо для изучения развития нейронных связей.
- Препарирование и культивирование этих нейронов позволяют проводить детальные клеточные исследования.
- Данный метод может помочь в поиске потенциальных терапевтических стратегий лечения травм спинного мозга.
Цель исследования
- Предоставить надежный метод выделения комиссуральных нейронов из эмбрионов крысы.
- Облегчить изучение роста и наведения аксонов в контролируемой среде.
- Углубить понимание клеточных механизмов, участвующих в развитии нервной системы.
Используемые методы
- Извлечение эмбрионов крыс на 13-й день развития (E13).
- Диссекция спинного мозга и подготовка образцов в конфигурации «открытой книги».
- Диссоциация дорсальной ткани в суспензию одиночных клеток с помощью трипсина и механического разрушения.
- Культивирование комиссуральных нейронов на поверхностях, покрытых полилизином.
Основные результаты
- Успешное выделение и культивирование комиссуральных нейронов из спинного мозга крыс на стадии E13.
- Подтвержденная жизнеспособность культивируемых нейронов для дальнейших экспериментальных исследований.
- Обеспечен воспроизводимый метод изучения роста и наведения аксонов.
- Создана возможность изучения клеточных и молекулярных механизмов в лабораторных условиях.
Выводы
- Описанный метод эффективен для выделения и культивирования комиссуральных нейронов.
- Данный подход может внести значительный вклад в исследования развития нервной системы.
- В будущих исследованиях эти культивируемые нейроны могут быть использованы для изучения терапевтических вмешательств.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод позволяет выделять высокообогащенные культуры комиссуральных нейронов из эмбрионального спинного мозга, создавая редукционную систему для изучения механизмов наведения аксонов. Такие препараты способствуют валидации мишеней в исследованиях нейроразвития, позволяя детально изучать механизмы отклика на сигналы наведения в контролируемых и воспроизводимых условиях. Данный подход способствует снижению рисков на доклиническом этапе за счет получения количественных показателей фенотипа для исследований модуляции сигнальных путей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связанные с путями наведения аксонов, с помощью функциональных анализов на очищенных комиссуральных нейронах.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированную систему получения нейрональных культур высокой степени чистоты (>90% чистоты) для проведения воспроизводимых исследований взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Создается релевантная для патологий система для скрининга соединений, модулирующих поворот аксонов, динамику конуса роста или чувствительность к сигналам наведения.
- Практическая ценность: Обеспечивается стандартизация анализа за счет четко определенных сроков диссоциации, посева и созревания, что способствует воспроизводимой оценке соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Предлагает платформу для механистического снижения рисков с целью оценки взаимодействия с мишенью и модуляции сигнальных путей в контексте развития, релевантном для человека.
- Практическая ценность: Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации, предоставляя количественные анализы роста и поворота аксонов в качестве трансляционных биомаркеров.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум процесса поиска новых лекарств, обеспечивая проверку гипотез на ранних этапах и разработку анализов для мишеней нейроразвития, при этом полученные результаты служат основой для идентификации ведущих соединений и принятия решений о переходе к доклиническим исследованиям.
- Фундаментальная биология: способствует уточнению путей передачи сигналов и снижению биологических рисков, позволяя напрямую наблюдать ответы аксонов на сигналы наведения, такие как нетрины, слиты и морфогены.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных данных, пригодных для визуализации (длина аксонов, морфология конуса роста, углы поворота), что подходит для автоматизированного или высококонтентного скрининга.
- Аналитика: позволяет генерировать измеримые зависимые переменные, включая скорость роста аксонов, точность траектории и экспрессию маркеров (DCC, LH2, TAG1) для статистического сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает связь с доклинической работой через консервативные механизмы наведения аксонов, что позволяет экстраполировать эффекты модуляции мишеней на разные виды.
- Повторное использование в организации: создает воспроизводимую платформу подготовки нейронов, применимую в многочисленных исследованиях сигналов наведения и кампаниях по скринингу соединений.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения биологического шума благодаря использованию высокообогащенных нейрональных культур.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость за счет стандартизированных протоколов диссекции, диссоциации и высева клеток.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет получения ранних механистических данных о влиянии модуляции мишеней на наведение аксонов.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию мишеней нейроразвития с учетом рисков на основе функциональной валидации в физиологически релевантной нейрональной модели.
Особенности реализации
- Требуется опыт в диссекции эмбриональных тканей и методах стерильного культивирования нейронов.
- Необходимо наличие доступа к эмбрионам с определенным сроком беременности, диссекционному микроскопу и оборудованию для диссоциации с использованием трипсина.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами при выборе ширины дорсальной полоски для обеспечения баланса между выходом клеток и чистотой популяции.
- Необходимо адаптировать плотность посева и время созревания для различных форматов анализа (например, иммунофлуоресценции в сравнении с биохимическим анализом).
- Метод ограничен эмбриональным происхождением ткани, что исключает возможность проведения лонгитюдных исследований за пределами ранних стадий развития.
