Первичные человеческие бронхиальные эпителиальные клетки, выращенных из эксплантов

В данной статье мы описываем протокол роста и наращивания эпителиальных клеток бронхов человека из свежевыделенных сегментов бронхов человека. Этот протокол состоит из пяти разделов, кодирования и скретка, ста миллиметровых культуральных планшетов, восстановления бронхиальной ткани, экспланных трансплантаций бронхиальной ткани, пассажа эпителиальных клеток бронхов человека, выращивания реснитчатых, эпителиальных клеток бронхов человека на трансвеллах. Прежде чем начать, обратите внимание, что все действия выполняются в шкафу биологической безопасности.

Если не указано иное, пожалуйста, ознакомьтесь с разделом «Материалы, реагенты и препараты» и убедитесь, что вы подготовились заранее. Следующее кодирование, культура стокового раствора, среда диссоциации растворов, нанесение покрытий и скретчинга. Стомиллиметровые культивальные пластины следует делать в бст.

Держите все стерильно. Поместите стерильные стомиллиметровые культуральные планшеты и покрытие раствором. В пипетке BST две мельницы для нанесения покрытия и стомиллиметровая пластина вращаются вокруг для покрытия основания пластины.

Убедитесь, что раствор покрытия равномерно покрывает основание плиты. Измельчите остатки раствора пипеткой и с его помощью нанесите покрытие на вторую сотметровую пластину. Повторите для такого количества тарелок, сколько нужно.

Количество необходимых планшетов варьируется в зависимости от количества тканевых эксплантов. Следите за тем, чтобы раствор покрытия равномерно покрывал основание пластин. Как и было продемонстрировано.

Накройте тарелки Их крышками. Дайте планшетам высохнуть в инкубаторе в течение одного-двух часов и аспирируйте доступ раствором перед использованием Для расширения бронхиальной ткани. Неиспользованные культуральные планшеты с покрытием можно поместить в стерильный пакет и хранить при температуре четыре градуса Цельсия на потом.

Используйте чистые, маленькие, острые ножницы, скальпель и щипцы с 70% этанолом и внесите в покрытые царапинами пластины BSC, сильно надавливая им скальпелем до образования глубоких маленьких XS не менее четырех на пластину. Если царапина недостаточно глубока, кусочки ткани не осядут в шприцах и будут плавать за ее пределами. Тщательно промойте выделенную бронхиальную ткань человека в Bss out.

Откройте бронхиальные части. Введите ткань в BS и перенесите в стерильную сотметровую тканевую культуральную пластину с названием DM EM ham F 12 плюс 1% антибиотик антимикотический. С помощью острых маленьких ножниц разрежьте ткань на кубики по два-три миллиметра.

Поместите по одному кусочку разрезанной ткани в центр каждого X с помощью щипцов и прижмите. Аккуратно дайте кусочкам ткани или X-эксплантам прилипнуть к пластине в течение нескольких секунд. А затем аккуратно добавьте 10 мил готовой среды Если ткань всплывает После добавления среды используйте щипцы, чтобы протолкнуть ткань в гребни X-хромоскопии или сделать новую X.It может потребоваться сделать новую X-хромосому, если гребни недостаточно глубоки.

Поместите планшеты в инкубатор и меняйте среды каждые три-четыре дня, чтобы ткани были готовы к пересадке. Когда вокруг тканей выросло достаточное количество эпителиальных клеток, чтобы покрыть одну-два сантиметра площади, это занимает примерно четыре недели. Используйте стомиллиметровое покрытие и поцарапанные пластины.

Так как некоторые тканевые выделения могут оказаться не успешными. Количество пластин зависит от того, сколько кусочков ткани вы пересаживаете. Если вы используете пластины, которые были предварительно покрыты и хранились при температуре четыре градуса Цельсия, доведите до комнатной температуры перед использованием С помощью щипцов осторожно возьмите ткань с исходной пластины и поместите ее в центр оси в новую пластину и аккуратно прижмите ткани без нароста.

Дайте салфетке прилипнуть к пластине. В течение нескольких секунд добавьте среду и инкубируйте. Добавьте, как описано ранее, для X explan.

Таким образом, два миллиона поездок и стоковый раствор EDTA для каждой ста миллиметровой тканевой культуральной пластины. Разбавьте исходный материал шестью милами стерила 0,01 молярного PBS и двумя милами исходного раствора до шести мил PBS для получения конечной концентрации трипсина в двух 50 микрограммах на милл и для ЭДТА в дозе 10 микрограммов на мил. После перемещения эксплантов на новую пластину, аспирируйте среду из пластин с одно-двумя сантиметровыми кольцами клетки.

Добавьте восемь мил теплых разведенных капель и нанесите раствор на каждую стомиллиметровую пластину. И поместите инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на три-15 минут. Проверяйте часто.

Если оставить трипсин включенным слишком долго, клетки могут быть повреждены. Проверьте планшеты под микроскопом, чтобы убедиться, что большинство клеток были подняты, клетки округляются вверх и отделяются, как показано при восьми милах тепла. 10% FBS в среде на пластину для инактивации раствора EDT.

Объедините объемы всех пластин в одну пробирку или отдельные пробирки из разных тканей. Подсчитайте клетки с помощью центрифуги Hema Cytometer при весе G в течение пяти минут. Клеточная гранула образуется в основании пробирки для ресуспензии клеточной гранулы в полной среде до желаемой концентрации клеток.

Поместите от двух до 3 миллионов ячеек в колбу T 75 и при необходимости добавьте весь фильтрующий материал. Инкубируйте и меняйте среду. Каждые три-четыре недели клетки вырастают до субслияния в колбах D 75.

Примерно через четыре недели клетки должны быть подняты и расширены или использованы при субслиянии, чтобы предотвратить сене. Начните с подготовки проницаемых мембран транслунгов. Используйте 6,5-миллиметровые вставки, которые подходят для 24-луночных многолуночных планшетов.

Добавьте среду с обеих сторон мембраны. Точка шесть мил внизу и 0,1 мил вверху. Инкубируйте один час в инкубаторе для клеточных культур.

Осторожно удалите среду с обеих сторон мембраны. Начиная с базального объема сначала осторожно, это означает, что мембрану можно легко повредить. Поэтому пипеткой подайте среду вниз по боковой стороне вкладыша для культуры, используйте рекомендованный объем.

Если этого не сделать, это приведет к утечке среды из других скважин к семенным клеткам. После предварительной инкубации проницаемой подложки осторожно введите клеточную суспензию в эпическую сторону мембраны на 6,5 миллиметровых лунок с концентрацией 0,1 мил клеточной суспензии на эпическую сторону мембраны. Пипетка 0,6 М, средняя на базальной стороне мембраны.

Подкармливайте клетки с эпической и прикорневой сторон в течение 10 дней. Чтобы наладить хорошо дифференцированный культурообмен, проводите медицину два раза в неделю. Используя продемонстрированный метод, удалите базальный объем.

Сначала замените эпический объем, добавьте 0,6 мил среды к базальной стороне мембраны. Этот метод способствует прикреплению клеток к мембране и предотвращает воздействие воздуха на клетки в течение длительного периода времени. Быстро обменяйте носители и поставьте обратно инкубатор.

Создайте воздушно-жидкостную границу раздела на 10-й день, удалив среду AAL и заменив среду 0,6 мил на базальной стороне мембраны. Выдерживайте клетки в воздушной жидкости на границе раздела в течение шести недель меняйте среду два раза в неделю. Реснитчатые клетки начнут появляться через четыре недели после создания уха.

Жидкий интерфейс. Клетки достигают равномерной дифференцировки в реснитчатые клетки. Через шесть недель после создания интерфейса The ear liquid interface.

Бронхиальные сегменты человека со здоровыми эпителиальными клетками из эксплана и трансплантатов. В нашем исследовании успешные посевы из эксплана бронхиальной ткани имели место в восьми из девяти тканей. При инфицировании одной из эксплан-культур радиус колец эпителиальных клеток достигал одного-двух сантиметров за три-четыре недели.

Успешные X-экспланы культивировались повторно до шести раз. Все успешные культуры демонстрируют признаки миграции клеток в течение 48 часов после начала трансплантации, или X-эксплан, как показано у В-клеток, имеют булыжник, характерный для этих эпителиальных клеток, как показано на В. И на последующих рисунках иммуноокрашивание цитозиновых препаратов клеток из эксплана и клеток, посеянных на покровных листках, показало, что все клетки были положительными на специфический эпителий цитокератин, Здесь показаны бронхиальные клетки субкультуры человека, выращенные до субслияния и колб T 75. Обратите внимание на внешний вид булыжника.

Субкультуральные бронхиальные клетки человека показали равномерное положительное иммуноокрашивание на керин и E.Can him иммуноокрашивание специфическими антителами против других типов клеток не показало каких-либо признаков контаминации культур фибробластами, мезенхимальными или эндотелиальными клетками. Для получения более подробной информации, пожалуйста, обратитесь к рисунку 5 и его подписи в тексте: клетки культивируются на проницаемых полиэфирных мембранах или трансвеллах с жидкой границей, дифференцированной в реснитчатый эпителий, как показано здесь, отбрасывают клетки и их или трансплантируют, если клетки с другой морфологией, как показано здесь, начинают появляться. В этом протоколе мы представили подробные методы культивирования и расширения первичных эпителиальных клеток бронхов человека.

Исследования на клетках человека необходимы для определения важных путей развития механизмов заболевания легких человека, а также для токсичности и фармакологического скрининга нового препарата. Мы надеемся, что описанные здесь методы побудят вас культивировать эпителиальные клетки бронхов человека из эксплантов и использовать эти клетки в ваших исследовательских системах. Спасибо и удачи.