Первичные человеческие бронхиальные эпителиальные клетки, выращенных из эксплантов

В данной статье мы описываем протокол культивирования и экспансии эпителиальных клеток бронхов человека, полученных из свежевыделенных сегментов бронхов человека. Данный протокол состоит из пяти разделов: кодирование и скарификация, использование 100-мм культуральных планшетов, подготовка ткани бронхов, эксплантация трансплантатов ткани бронхов, пассирование реснитчатых эпителиальных клеток бронхов человека и культивирование эпителиальных клеток бронхов человека на трансвеллах. Перед началом работы обратите внимание, что все этапы выполняются в боксе биологической безопасности.

Если не указано иное, пожалуйста, ознакомьтесь с разделом «Материалы, реагенты и подготовка» и убедитесь, что все необходимые подготовительные мероприятия выполнены. Следующие этапы: кодирование, подготовка культур стоковых растворов, приготовление сред, растворов для диссоциации, покрытие и создание царапин. Подготовку культурных планшетов диаметром 100 мм следует выполнить заранее.

Соблюдайте полную стерильность. Подготовьте стерильные культуральные чашки диаметром 100 мм и раствор для покрытия. С помощью пипетки перенесите 2 мл раствора для покрытия в чашку диаметром 100 мм и осторожно перемешайте содержимое круговыми движениями, чтобы равномерно покрыть дно чашки.

Убедитесь, что раствор для покрытия равномерно покрывает дно планшета. Отпипетируйте оставшийся раствор и используйте его для покрытия второго планшета диаметром 100 мм. Повторите процедуру для всех необходимых планшетов.

Количество необходимых планшетов зависит от числа эксплантатов ткани. Убедитесь, что раствор для покрытия равномерно покрывает дно планшетов, как показано в видео.

Накройте планшеты крышками. Оставьте планшеты высыхать в инкубаторе от одного до двух часов и перед использованием для эксплантации бронхиальной ткани аспирируйте избыток раствора. Неиспользованные планшеты с покрытием можно поместить в стерильный пакет и хранить при температуре 4 °C для последующего применения.

Продезинфицируйте с помощью спрея небольшие острые ножницы, скальпель и пинцет 70% ethanol, затем поместите в BSC планшеты с нанесенными царапинами, с силой нажимая на них скальпелем для создания глубоких небольших XS (минимум четыре на планшет). Если царапина будет недостаточно глубокой, фрагменты ткани не закрепятся и будут плавать. Вынесите ткань из BSC и поместите ее в чашку P three. Тщательно промойте изолированную ткань бронхов человека в Bss out.

Раскройте фрагменты бронхов. Перенесите ткань в BS, а затем в стерильный 100-мм планшет для культивирования тканей с охлажденным DM EM ham F 12 с добавлением 1% антибиотика-антимикотика. Используя маленькие острые ножницы, измельчите ткань на кусочки кубической формы размером 2–3 мм.

С помощью пинцета поместите один фрагмент разрезанной ткани в центр каждого X и прижмите. Осторожно дайте фрагментам ткани или эксплантам X прикрепиться к пластине в течение нескольких секунд. Затем аккуратно добавьте 10 мл полной среды. Если после добавления среды ткань всплывает, используйте пинцет, чтобы протолкнуть её в гребни X, или сделайте новый X. Может потребоваться создание новых X, если гребни недостаточно глубокие.

Поместите планшеты в инкубатор и меняйте среду каждые три-четыре дня до тех пор, пока ткани не будут готовы к трансплантации. Когда вокруг тканей вырастет достаточное количество эпителиальных клеток, чтобы покрыть области размером от одного до двух сантиметров (это занимает примерно четыре недели), используйте покрытые и поцарапанные планшеты диаметром 100 мм.

Поскольку некоторые экспланты тканей могут не прижиться, количество планшетов зависит от количества пересаживаемых фрагментов ткани. Если используются планшеты, которые были предварительно покрыты и хранились при температуре четырех градусов Цельсия, перед использованием доведите их до комнатной температуры. С помощью пинцета аккуратно извлеките ткань из исходного планшета, поместите её в центр новой лунки и слегка прижмите. Ткани без признаков разрастания следует утилизировать.

Дайте ткани прикрепиться к планшету. Добавьте среду и инкубируйте в течение нескольких секунд. Добавьте, как было описано ранее для X explan.

Таким образом, на каждую 100-миллиметровую чашку для культивирования тканей берут по 2 мл стокового раствора трипсина и EDTA. Разбавьте стоковый раствор 6 мл стерильного 0,01 M PBS; при добавлении 2 мл стокового раствора к 6 мл PBS конечная концентрация трипсина составит 250 µg/ml, а EDTA — 100 µg/ml. После переноса эксплантатов на новую чашку аспирируйте среду из чашек, в которых сформировались кольца клеток диаметром 1–2 см.

Добавьте по 8 мл теплого разведенного раствора капель и ЭДТА в каждую 100-миллиметровую чашку. Поместите в инкубатор при температуре 37 °C на 3–15 минут. Проверяйте часто.

Слишком длительное воздействие трипсина приведет к повреждению клеток. Проверьте планшеты под микроскопом, чтобы убедиться, что большинство клеток открепились; клетки станут округлыми и отделятся, как показано на восьмиминутном видео. Добавьте по 10% FBS в среду в каждый планшет, чтобы инактивировать раствор ЭДТА.

Объедините объемы со всех планшетов в одну пробирку или в отдельные пробирки для разных тканей. Подсчитайте количество клеток, используя камеру Горяева, или центрифугируйте при 100 G в течение пяти минут. В нижней части пробирки образуется осадок клеток; ресуспендируйте осадок клеток в полной среде до достижения желаемой концентрации клеток.

Поместите от 2 до 3 миллионов клеток в каждый флакон T 75 и добавьте полный раствор среды в необходимом объеме. Инкубируйте и замените среду. Каждые три-четыре недели клетки в флаконах D 75 достигают субконфлюэнтного состояния.

Примерно через четыре недели клетки следует отделить и пересеять или использовать при субконфлюэнтном состоянии, чтобы предотвратить старение. Начните с подготовки проницаемых мембран трансвелл-вставок. Используйте вставки диаметром 6,5 мм, подходящие для 24-луночных планшетов.

Добавьте среду по обе стороны мембраны. 0,6 мл снизу и 0,1 мл сверху. Инкубируйте в течение одного часа в инкубаторе для культур клеток.

Осторожно удалите среду с обеих сторон мембраны. Начните с базального объема; будьте предельно аккуратны, так как мембрана легко повреждается. Поэтому отбирайте среду пипеткой, прижимая кончик к стенке культурального вкладыша, используя рекомендуемый объем.

В противном случае среда может перетечь в соседние лунки с посеянными клетками. После предварительной инкубации проницаемого фильтра осторожно внесите суспензию клеток на апикальную сторону мембраны: для лунок диаметром 6,5 мм добавьте 0,1 мл суспензии клеток на апикальную сторону мембраны. Внесите 0,6 мл среды на базальную сторону мембраны.

Питайте клетки с эпикальной и базальной сторон в течение 10 дней. Для получения хорошо дифференцированной культуры заменяйте среду дважды в неделю. Удаляйте базальный объем, используя продемонстрированный метод.

Сначала замените эпикальный объем, добавив 0,6 мл среды на базальную сторону мембраны. Этот метод способствует прикреплению клеток к мембране и предотвращает их длительный контакт с воздухом. Быстро замените среду и верните образец в инкубатор.

На 10-й день создайте границу раздела воздух-жидкость, удалив среду AAL и заменив 0,6 мл среды на базальной стороне мембраны. Содержите клетки в условиях границы раздела воздух-жидкость в течение шести недель, меняя среду дважды в неделю. Реснитчатые клетки начнут появляться через четыре недели после создания данной среды.

Жидкий интерфейс. Клетки достигнут равномерной дифференцировки в реснитчатые клетки. Спустя шесть недель после создания жидкого интерфейса ушного эпителия.

Сегменты бронхов человека со здоровыми эпителиальными клетками, полученные из эксплантатов и трансплантатов. В нашем исследовании успешное культивирование эксплантатов бронхиальной ткани было достигнуто в восьми из девяти образцов. Поскольку одна из культур эксплантатов была инфицирована, кольца эпителиальных клеток достигли радиуса от одного до двух сантиметров в течение трех-четырех недель.

Успешные эксплантаты X культивировали повторно до шести раз. Все успешные культуры демонстрировали признаки миграции клеток в течение 48 часов после начала трансплантации, или эксплантаты X, как показано на рисунке B, имели «булыжную» морфологию, характерную для этих эпителиальных клеток, как видно на рисунке B. В последующих фигурах иммуноокрашивание цитопрепаратов клеток из эксплантата и клеток, высеянных на покровные стекла, показало, что все клетки были положительны на эпителий-специфичный цитокератин; здесь представлены субкультуры бронхиальных клеток человека, выращенные до субконфлюэнтности в колбах T 75. Обратите внимание на «булыжную» морфологию.

Субкультивированные бронхиальные клетки человека показали равномерное положительное иммуноокрашивание на кератин и E.Cad. Иммуноокрашивание со специфическими антителами против других типов клеток не выявило признаков контаминации культур фибробластами, мезенхимальными или эндотелиальными клетками. Для получения более подробной информации, пожалуйста, обратитесь к рисунку 5 и подписи к нему в тексте. Клетки, культивируемые на проницаемых полиэфирных мембранах или трансвеллах с жидким интерфейсом, дифференцировались в реснитчатый эпителий, как показано здесь; следует утилизировать клетки и их трансплантаты, если начинают появляться клетки с иной морфологией, чем продемонстрировано здесь. В данном протоколе мы представили подробные методы культивирования и экспансии первичных эпителиальных клеток бронхов человека.

Исследования на основе человеческих клеток необходимы для определения важных путей механизмов заболеваний легких человека, а также для токсикологического и фармакологического скрининга новых лекарственных препаратов. Мы надеемся, что описанные здесь методы побудят вас культивировать эпителиальные клетки бронхов человека из эксплантатов и использовать эти клетки в ваших исследовательских системах. Благодарим вас и желаем удачи.