Первичные человеческие бронхиальные эпителиальные клетки, выращенных из эксплантов

В данной статье мы описываем протокол культивирования и экспансии эпителиальных клеток бронхов человека, полученных из свежевыделенных сегментов бронхов человека. Этот протокол состоит из пяти разделов: кодирование и создание царапин, 100-миллиметровые культуральные планшеты, восстановление бронхиальной ткани, эксплантаты пересаженной бронхиальной ткани, пассирование реснитчатых эпителиальных клеток бронхов человека, эпителиальные клетки бронхов человека на трансвеллах. Перед началом работы обратите внимание, что все этапы выполняются в шкафу биологической безопасности.

Если не указано иное, пожалуйста, ознакомьтесь с разделом «Материалы, реагенты и подготовка» и убедитесь, что все необходимые приготовления выполнены. Следующие этапы: кодирование, подготовка стоковых растворов и культур, приготовление сред, растворов для диссоциации, покрытие и нанесение царапин на культуральных чашках диаметром 100 мм должны быть выполнены заранее.

Соблюдайте стерильность всех материалов. Подготовьте стерильные культуральные чашки диаметром 100 мм и раствор для покрытия. С помощью пипетки перенесите 2 мл раствора для покрытия в чашку диаметром 100 мм и перемешайте круговыми движениями, чтобы равномерно покрыть дно чашки.

Убедитесь, что раствор для покрытия равномерно распределен по дну планшета. Пипеткой удалите остатки раствора и используйте их для покрытия второго планшета диаметром 100 мм. Повторите процедуру для всех необходимых планшетов.

Количество необходимых планшетов зависит от числа эксплантов ткани. Убедитесь, что раствор для покрытия равномерно покрывает дно планшетов, как показано на видео.

Накройте планшеты крышками. Оставьте планшеты высыхать в инкубаторе от одного до двух часов и перед использованием для эксплантации бронхиальной ткани аспирируйте избыток раствора. Неиспользованные покрытые культуральные планшеты можно поместить в стерильный пакет и хранить при температуре 4 °C для последующего использования.

Продезинфицируйте с помощью распылителя небольшие острые ножницы, скальпель и пинцет 70% ethanol, затем поместите в BSC планшеты с нанесенными царапинами, с силой нажимая скальпелем для создания глубоких небольших XS (минимум четыре на планшет). Если царапина будет недостаточно глубокой, фрагменты ткани не закрепятся в Syringes и будут плавать. Вынесите ткань из BSC и поместите ее в чашку P three. Тщательно промойте изолированную ткань бронхов человека в Bss out.

Раскройте фрагменты бронхов. Перенесите ткань в BS, а затем в стерильный 100-миллиметровый планшет для культивирования тканей с охлажденным DMEM/F-12 с добавлением 1% антибиотика-антимикотика. Используя маленькие острые ножницы, разрежьте ткань на фрагменты в виде кубиков размером 2–3 мм.

С помощью пинцета поместите по одному кусочку разрезанной ткани в центр каждого X и прижмите. Осторожно дайте кусочкам ткани или эксплантатам X прикрепиться к планшету в течение нескольких секунд. Затем аккуратно добавьте 10 мл полной среды. Если после добавления среды ткань всплывает, используйте пинцет, чтобы протолкнуть её в бороздки X, или создайте новый X. Может потребоваться создание новых X, если бороздки недостаточно глубокие.

Поместите планшеты в инкубатор и меняйте среду каждые три-четыре дня до тех пор, пока ткани не будут готовы к трансплантации. Дождитесь, пока вокруг тканей вырастет достаточное количество эпителиальных клеток, чтобы покрыть области размером от одного до двух сантиметров; это занимает примерно четыре недели. Используйте покрытые и поцарапанные планшеты диаметром 100 мм.

Поскольку некоторые эксплантаты тканей могут не прижиться, количество планшетов зависит от числа пересаживаемых фрагментов ткани. Если используются планшеты, которые были предварительно покрыты и хранились при температуре 4 °C, перед использованием доведите их до комнатной температуры. С помощью пинцета осторожно перенесите ткань из исходного планшета в центр новой лунки и слегка прижмите. Ткани без признаков роста следует утилизировать.

Дайте ткани прикрепиться к планшету. Через несколько секунд добавьте среду и инкубируйте. Добавьте, как было описано ранее для X explan.

Таким образом, на каждую 100-мм чашку для культивирования тканей берут 2 мл стокового раствора трипсина и EDTA. Разводят стоковый раствор 6 мл стерильного 0,01 М PBS; при добавлении 2 мл стокового раствора к 6 мл PBS конечная концентрация трипсина составляет 250 µg/ml, а EDTA — 100 µg/ml. После переноса эксплантатов на новую чашку аспирируют среду из чашек, содержащих клеточные кольца диаметром 1–2 см.

Добавьте по 8 мл теплого разведенного раствора капель и ЭДТА в каждую 100-мм чашку. Поместите в инкубатор при 37 °C на 3–15 минут. Регулярно проверяйте результат.

Слишком длительное воздействие трипсина приведет к повреждению клеток. Проверьте планшеты под микроскопом, чтобы убедиться, что большая часть клеток открепилась; клетки станут округлыми и отделятся, как показано на отметке 8 минут. Добавьте по 10% FBS в среду на каждый планшет для инактивации раствора ЭДТА.

Объедините объемы со всех планшетов в одну пробирку или в отдельные пробирки для разных типов тканей. Подсчитайте количество клеток, используя гемоцитометр. Центрифугируйте пробу при 100 ×g в течение пяти минут. На дне пробирки образуется осадок клеток; ресуспендируйте осадок клеток в полной среде до достижения желаемой концентрации клеток.

Поместите от 2 до 3 миллионов клеток в каждый флакон T 75 и добавьте необходимый объем полной среды. Инкубируйте и замените среду. Каждые три-четыре недели клетки в флаконах D 75 вырастают до субконфлюэнтного состояния.

Примерно через четыре недели клетки следует снять и пересеять или использовать при субконфлюэнтном состоянии, чтобы предотвратить старение. Начните с подготовки проницаемых мембран трансвеллов. Используйте вставки диаметром 6.5 мм, подходящие для многолуночных планшетов на 24 лунки.

Добавьте среду с обеих сторон мембраны. 0,6 мл снизу и 0,1 мл сверху. Инкубируйте в течение одного часа в инкубаторе для культур клеток.

Осторожно удалите среду с обеих сторон мембраны. Начните с базального объема; будьте предельно аккуратны, так как мембрана может быть легко повреждена. Поэтому переносите среду пипеткой по стенке культурального вкладыша, используя рекомендуемый объем.

В противном случае среда может перетечь в соседние лунки с посеянными клетками. После преинкубации проницаемой подложки осторожно внесите суспензию клеток на апикальную сторону мембраны в лунки диаметром 6,5 мм, используя 0,1 мл суспензии клеток на апикальную сторону мембраны. Внесите пипеткой 0,6 мл среды на базальную сторону мембраны.

Проводите питание клеток с эпикальной и базальной сторон в течение 10 дней. Для получения хорошо дифференцированной культуры заменяйте среду дважды в неделю. Используя продемонстрированный метод, удалите базальный объем.

Сначала замените эпикальную среду, добавив 0,6 мл среды с базальной стороны мембраны. Этот метод способствует прикреплению клеток к мембране и предотвращает их длительный контакт с воздухом. Быстро замените среду и верните образец в инкубатор.

На 10-й день создайте границу раздела воздух-жидкость, удалив среду AAL и заменив 0,6 мл среды на базальной стороне мембраны. Содержите клетки в условиях границы раздела воздух-жидкость в течение шести недель, меняя среду дважды в неделю. Реснитчатые клетки начнут появляться через четыре недели после создания данной границы.

Жидкий интерфейс. Клетки достигнут единообразной дифференцировки в реснитчатые клетки. Через шесть недель после создания жидкого интерфейса уха.

Сегменты бронхов человека со здоровыми эпителиальными клетками, полученные из эксплантатов и трансплантатов. В нашем исследовании успешное культивирование эксплантатов бронхиальной ткани было достигнуто в восьми из девяти образцов. Поскольку одна из культур эксплантатов была инфицирована, кольца эпителиальных клеток достигли радиуса от одного до двух сантиметров в течение трех-четырех недель.

Успешные эксплантаты X подвергались повторному культивированию до шести раз. Все успешные культуры демонстрировали признаки миграции клеток в течение 48 часов после начала трансплантации, либо эксплантаты X, как показано на панели B, имели вид «булыжной мостовой», характерный для данных эпителиальных клеток, что видно на панели B. На последующих рисунках иммуноокрашивание цитозиновых препаратов клеток из эксплантатов и клеток, высеянных на покровные стекла, показало, что все клетки были положительны по специфическому для эпителия цитокератину; здесь представлены человеческие субкультуры бронхиальных клеток, выращенные до субконфлюэнтного состояния в колбах T 75. Обратите внимание на вид «булыжной мостовой».

Субкультуры бронхиальных клеток человека продемонстрировали равномерное положительное иммуноокрашивание на кератин и E.cadherin. Иммуноокрашивание со специфическими антителами к другим типам клеток не выявило признаков контаминации культур фибробластами, мезенхимальными или эндотелиальными клетками. Для получения более подробной информации, пожалуйста, обратитесь к рисунку 5 и подписи к нему в тексте. Клетки, культивируемые на проницаемых полиэстеровых мембранах или в трансвеллах с жидкостным интерфейсом, дифференцировались в реснитчатый эпителий, как показано здесь; следует утилизировать клетки и их трансплантаты, если начинают появляться клетки с иной морфологией, чем продемонстрировано здесь. В данном протоколе мы представили детальные методы культивирования и экспансии первичных эпителиальных клеток бронхов человека.

Исследования на основе человеческих клеток необходимы для определения важных путей механизмов заболеваний легких человека, а также для токсикологического и фармакологического скрининга новых препаратов. Мы надеемся, что описанные здесь методы побудят вас культивировать эпителиальные клетки бронхов человека из эксплантатов и использовать эти клетки в ваших исследовательских системах. Благодарим вас и желаем удачи.