Всеобъемлющее Композиционные Анализ стен растительной клетки (лигноцеллюлозной биомассы) Часть II: Углеводы

Определение матричного полисахаридного состава и содержания кристаллической целлюлозы в клеточных стенках растений начинается с высушенного растительного материала, который подвергается различным экстракциям. Полученный материал состоит только из клеточных стенок, а затем расщепляется для определения матричного полисахаридного состава. Материал стенки обрабатывается слабой кислотой для гидролиза, некристаллическими полисахаридами, которые в основном представляют собой гемоцеллюлозы в их моносахариды.

Затем моносахариды получают в соответствующие им летучие альдолацетаты, которые затем анализируют и количественно оценивают с помощью газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометром для определения кристаллической целлюлозы. Стенки содержимого обрабатываются графическим реагентом, смесью кислот, которые удаляют некристаллические компоненты стенки. Оставшаяся кристаллическая целлюлоза расщепляется на свой мономер глюкозу, который может быть проанализирован метрически.

Определение содержания и состава лигнина продемонстрировано в другой видеопубликации J под названием «Комплексный анализ состава клеточных стенок растений, часть 1 лигнина». Здравствуйте, меня зовут Маркус Поли, я возглавляю аналитическую установку Wall в Биоэнергетическом исследовательском центре Великих озер в Университете штата Мичиган. Я Клифф Фостер, менеджер аналитического центра клеточных стенок.

Сегодня мы покажем вам, как определить состав полисахаридов, присутствующих в материале клеточной стенки растения, которым является целлюлоза в различных Homo целлюлозах. Здесь, в Исследовательском центре биоэнергетики Великих озер, мы разрабатываем технологию преобразования этих сахаров в биотопливо. Для того, чтобы определить оптимальное растительное сырье, нам сначала нужно оценить вид и обилие сахаров, которые присутствуют в этой биомассе.

В другом видео, озаглавленном «Комплексный анализ состава клеточных стенок растений, часть первая», мы сосредоточимся на анализе полифенолов. Итак, приступим. Начните эту процедуру с изоляции клеточных стенок.

Измельчите примерно от 60 до 70 миллиграммов высушенного растительного сырья с помощью 5,5-миллиметровых шариков из нержавеющей стали в двухмиловой трубке с винтовой крышкой SAR TED. Используя мельницу REM в качестве высокопроизводительной альтернативы, используйте робота для измельчения и дозирования, называемого eyewall, как описано в части первой. Когда шлифовка будет завершена, удалите стальные шарики.

Продолжайте изолировать клеточные стенки и удалять остаточный крахмал, как показано в части первой и описано в прилагаемом письменном протоколе. Отвесьте два миллиграмма материала клеточной стенки из крахмала DS в двухмельницную трубу. Высокопроизводительным способом выполнения этой задачи является робот-глаз.

Робот берет трубку, содержащую измельченный растительный материал, и проделывает отверстие в дне трубки. Затем проколотую трубку помещают на подаватель VI. Пустая трубка помещается на весы и перемещается под питатель VI с помощью вибрации материал просачивается через отверстие в загруженной верхней трубе в пустую нижнюю трубу до тех пор, пока не накопится желаемое количество материала.

Добавьте 100 микрограммов ацетола в качестве внутреннего стандарта. Промойте стенки трубки ацетоном, чтобы собрать материал клеточной стенки на дне трубки, и очень осторожно испарите ацетон под воздействием воздушного потока. Далее проводят слабокислотный гидролиз.

Осторожно добавьте 250 микролитров двух моляров трихлоруксусной кислоты или ТЖК в каждый образец, следя за тем, чтобы материал не попал на стенки трубки. Плотно закупорьте трубки и выдерживайте при температуре 121 градус Цельсия в нагревательном блоке в течение 90 минут. Затем охладите нагревательные блоки и образцы на льду и центрифугируйте пробирки при 10 000 об/мин в течение 10 минут.

Перелейте 100 микролитров кислотного надосадочного вещества, содержащего растворенные сахара полисахарида матрицы, в флаконы с завинчивающейся крышкой, следя за тем, чтобы не повредить материал гранул. Гранула может быть использована для анализа кристаллической целлюлозы. Испаряйте ТЖК в стеклянной трубке под слабой струей воздуха в испарительном устройстве.

Добавьте 300 микролитров двух пропанолов, чтобы удалить избыток кислотного вихря и испарить при температуре 25 градусов по Цельсию. Повторите в общей сложности три раза. Чтобы обеспечить идентификацию моносахаридов с помощью газовой хроматографии, проводят деривацию альдолацетата.

Во-первых, восстановите моносахариды до соответствующих альдол с открытым кольцом, которые затем ацетилируются. Обратитесь к прилагаемому письменному протоколу для получения подробных инструкций. Каждый этап процедуры проводится в соответствии с ранее показанным протоколом, добавление инкубационного испарения реагента под потоком воздуха с последующим удалением излишков реагента различными этапами промывки.

На заключительных этапах экстрагируются альдолацетаты. Сначала добавьте 500 микролитров этилацетата и слегка перемешайте. Затем добавьте два мила воды, закупорьте пробирки и вихрь, центрифугируйте пробирки при 2000 об/мин в течение пяти минут до получения прозрачных отдельных слоев с этилацетатом сверху, содержащим ацетаты Al Dettol, и водой на дне пипетки, 50 микролитров слоя этилацетата в флаконы GCMS со вставками разбавляют добавлением 100 микролитров ацетона в флакон GC и флакон GC можно хранить при четырех градусах Цельсия.

Если анализ GCMS не будет проведен немедленно, введите образцы в газовый фотоаппарат, оснащенный четырехкратным масс-спектрометром. Колонку и детали пробега можно найти в прилагаемом письменном протоколе. Исходным материалом для определения содержания кристаллической целлюлозы может быть изолированный материал клеточной стенки или материал стенки, уже обработанный слабокислотным ТФК, либо сразу после кислотной обработки, либо в пригодной для хранения в сушеной форме.

После удаления избытка ТЖК с помощью изопропанола, как показано ранее, добавьте к грануле ТЖК в двух М сарах в пробирке один М реагента up degra, состоящего из уксусной кислоты, азотной кислоты и воды, добавьте соотношение к объему восемь к одному-двум. Плотно закупорьте трубку и нагрейте на нагревательном блоке при температуре 100 градусов Цельсия в течение 30 минут. В результате такой обработки в грануле остается только кристаллическая целлюлоза.

Все остальные полисахариды гидролизуются холодными образцами в блоке на льду до комнатной температуры или более холодной. Затем центрифугируйте образцы при 10 000 об/мин в течение 15 минут после центрифугирования, выбросьте надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы гранула не была нарушена и из нее не был удален материал. Для этого оставьте в тюбике примерно 150 микролитров надосадочной жидкости, промойте гранулу несколько раз водой.

Далее проводят такой же гидролиз концентрированной серной кислотой с целью полного гидролиза кристалла и гранулы целлюлозы в глюкозу. Начните с добавления 175 микролитров 72%-ной серной кислоты в трубку сарты и выдерживайте в течение 30 минут при комнатной температуре. После первичной инкубации сделайте образец вихревым и инкубируйте еще 15 минут.

Затем добавьте 825 микролитров воды и вортекса и центрифугируйте образцы при 10 000 об/мин в течение пяти минут. Может быть некоторое количество коричневого и растворимого материала, в основном лигнина, остающегося в пробирке, пока глюкоза находится в надосадочной жидкости. Содержание глюкозы в надосадочной жидкости определяют с помощью колорметрического анализа антонов.

Этот анализ проводится в 96-луночном полистирольном микротитровом планшете. Восстановите стандартную кривую глюкозы в двух экземплярах, следуя инструкциям в прилагаемом письменном протоколе. Подготовьте образцы, соединив 10 микролитров каждого образца, супернат и 90 микролитров воды в отдельных лунках той же микротитровой пластины, что и стандартная отделка, добавив 200 микролитров свежеприготовленного и брошенного реагента.

Далее нагрейте тарелку в течение 30 минут при температуре 80 градусов Цельсия в духовке с алюминиевым теплоотводом. Обратите внимание, что образцы, содержащие глюкозу, меняют цвет с желтого на сине-зеленый после полного нагревания. Дайте тарелке остыть до комнатной температуры и тщательно встряхните.

Считывание поглощения на 625 нанометрах с помощью микротитровального планшетного ридера. Содержание глюкозы, строительного блока целлюлозы, рассчитывается на основе абсорбции по сравнению со стандартной кривой, установленной на той же пластине. Вот некоторые репрезентативные результаты полисахаридного анализа куска древесины тополя.

Пики газовой хроматограммы идентифицируются по профилям массы и/или времени удержания стандартов. Моносахариды количественно определяются на основе стандартных кривых. Анализ сахара матричных полисахаридов показывает высокое содержание ксилозы, представляющей собой хеми целлюлозу xam, но присутствуют и другие сахара.

Согласно анализу, 40% материала тополя состоит из кристаллов и целлюлозы. Обратите внимание, что эти составы и составы могут варьироваться от растения к растению или между различными анатомиями растений. Мы только что показали вам, как определить содержание полисахаридов и анализ состава биомассы лигнаноцеллюлозы для анализа полифеноллигнина.

Настройтесь на первую часть. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.