Многоэлектродной массива Записи вомероназального Эпителий
March 1st, 2010
Многоэлектродной массива (МЭС) записи обеспечивают метод для изучения электрической активности больших популяций нейронов. Здесь мы представляем подробности подготовки МЭС для записи с мышью вомероназального эпителия одновременно стимулирует ткани.
Планарные многоэлектродные матрицы используются для записи из носового органа UL. ВНО удаляется из мыши таким образом, что нейроэпителий остается неповрежденным. Сначала из мыши извлекается капсула VNO.
Затем нейроэпителий выделяется из костной капсулы, кровеносного сосуда и базальной пластинки. Ткань помещается в MEA дендритной бугоркой вверх. После того, как эта настройка завершена, мы используем роботизированную руку для введения жидких стимулов в ткани.
Здравствуйте, я Ханна Арнон из лаборатории Тима Уолли на кафедре анатомии и нейробиологии Медицинской школы Вашингтонского университета. Я Шайенн Фу, тоже из Святой лаборатории. Сегодня мы покажем вам процедуру регистрации V-образного носового органа с помощью многоэлектрической решетки.
Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения сенсорных свойств рецепторных нейронов в добавочной системе. Итак, приступим. Электрические записи получаются с помощью планарной многоэлектродной матрицы или MEA с плоскими электродами из нитрида титана толщиной 10 микрометров, изолированными нитридом кремния.
60 электродов расположены в двух полях, состоящих из сетки пять на шесть с расстоянием между центрами 30 микрометров. С помощью усилителя MEA 10 60 электрические сигналы усиливаются. Требуется 1000-кратный сигнал на частоте 10 килогерц.
С помощью карты сбора данных и специального программного обеспечения для сбора данных ткань удерживается на MEA с помощью нейлоновой сетки, которая прикреплена к специальной вставке, которая плотно прилегает к культуре. Теперь, когда мы увидели МЭА, давайте посмотрим, как проводить вскрытие VNO. Перед проведением вскрытия хорошо заполните МЭА бычьим сывороточным альбумином или БСА, затем промойте МЭА теплым раствором пузырькового рингера и положите его на лед.
Чтобы подготовиться к вскрытию, заполните две чашки Петри размером 60 на 15 миллиметров раствором с пузырьками и положите их на лед. Кроме того, наполните раствором кольцевого раствора две покрытые защитой порога чашки Петри одинакового размера и поставьте их на лед. Охладите еще 50 миллилитров пузырьковых рингеров для использования во время вскрытия.
Начните с убитой мыши, сделав двусторонние разрезы со стороны рта, идущей параллельно линии подбородка, к затылку. Соедините два надреза вдоль задней части шеи и удалите спинную часть головы, оставив нижнюю челюсть прикрепленной к мыши с помощью тонких ножниц. Разрежьте между тканью и по обе стороны от верхней челюстной кости, чтобы отделить ткань от кости.
Затем используйте щипцы номер три, чтобы отклеить ткань нёба, обнажив носовую полость с помощью маленьких ножниц или скальпеля, разрезанного между и по обе стороны от двух верхних передних зубов, чтобы освободить уязвимую носовую капсулу от кости с помощью щипцов номер три. Возьмите уязвимую носовую капсулу за плоскую кость и поместите ее в чашку Петри на льду. Предыдущие шаги по погружению VNO в охлаждаемые звонки должны быть выполнены менее чем за три минуты.
Чтобы предотвратить отмирание тканей, поместите чашку под стереомикроскоп, освещенный отраженным светом. Используйте щипцы номер три, чтобы удалить костную капсулу из одного VNO за раз. Используйте одну руку для стабилизации костной капсулы, захватывая ее с конца няни, а другой рукой отклейте кость от VNO, стараясь не повредить VNO.
После того, как кость будет удалена, переложите буквы v и o на чашку Петри, покрытую сигарой. Оставшуюся тарелку используйте для другого VNO. Переключите подсветку на использование проходящего света с помощью микроножниц.
Или щипцы номер пять. Отделите ВНО от кровеносного сосуда, разрезав его по краю. На этом этапе нервный лист будет полностью отделен от кровеносного сосуда.
Поместите VNO внутренней стороной вверх с помощью щипцов номер три. Закрепите VO на S-образной гарде в углу ткани с помощью небольшого фрагмента бритвенного лезвия с тефлоновым покрытием, удерживаемого зажимом. Очистите нервный эпителий от базальной пластинки, держа лезвие под небольшим углом менее 30 градусов от поверхности посуды.
Работает лучше всего. С помощью стеклянной пипетки. Перенесите кусочек нервного эпителия из чашки в MEA, расположите VNO на вершине электродного поля дендритной стороной вверх.
Удалите излишки раствора кольцевика с помощью пипетки, а затем поместите сетчатый держатель салфетки в лунку матрицы, чтобы удерживать vno на месте. Заполните лунку охлажденным раствором рингера с завершенным вскрытием. Чтобы начать сеанс записи, поместите MEA в усилитель MEA 10 60 и расположите нагревательный щуп прямо над тканью, чтобы убедиться в правильности нагрева.
Размещение зонда стимулируют раствором Рингера, содержащим 50 миллимоляров калия, в течение двух секунд. Отрегулируйте позиционирование, чтобы свести к минимуму задержку нейронного ответа на раствор калия. Ткань требует непрерывной суперфузии, которая достигается за счет подачи раствора звонка от насоса ВЭЖХ.
Нагрейте ткань с помощью нагретого раствора для рингера в течение от 45 минут до одного часа до записи, чтобы дать ткани акклиматизироваться. Стимулы подаются с помощью роботизированной манипулятора Gilson two 15 для работы с жидкостями. Они представлены путем выполнения инъекций в клапан ВЭЖХ и переключения между проточным потоком и петлей Под управлением программного обеспечения Gilson роботизированная рука подает стимулы в линию изобилия, поддерживая при этом постоянную скорость потока и давление.
Состояние клапана ВЭЖХ представлено электрическим напряжением, которое регистрируется компьютером регистрации в качестве дополнительного канала. Чтобы обеспечить синхронизацию с активностью нейронов, электрические сигналы сохраняются на диске с помощью специального программного обеспечения для записи. Теперь мы покажем вам некоторые репрезентативные результаты работы многоэлектрической матрицы VNO. Запись.
Эта процедура позволяет получить большие объемы данных благодаря большому количеству электродов, а препарат обычно остается стабильным в течение примерно шести часов. Вот пример данных за 400 миллисекунд из одной половины MEA. Эта процедура полезна для измерения реакции сенсорных нейронов на лиганды, показанная здесь, представляет собой реакцию на 100-кратно разбавленную мочу самки мыши, записанную с одного электрода.
Моча подавалась в течение 10 секунд, как указано черной полосой. Обратите внимание на увеличение возбуждения после предъявления стимула. Мы только что показали вам, как выполнять запись с помощью нескольких электроматриц на мыши VNO при выполнении этой процедуры.
Важно помнить о терпении. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В этом исследовании представлен метод записи электрической активности из обонятельного эпителия крысы с использованием многоэлектродных массивов (MEA). Подготовка включает изоляцию нейроэпителия и стимуляцию ткани с помощью роботизированной руки.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Электрофизиология
- Нейробиология
Фон
- Многоэлектродные массивы позволяют записывать активность больших популяций нейронов.
- Обонятельный орган (VNO) играет ключевую роль в обнаружении феромонов.
- Понимание электрической активности в VNO может дать представление об обработке сенсорной информации.
- Роботизированные руки могут повысить точность применения стимулов во время записей.
Цель исследования
- Продемонстрировать метод подготовки для записей MEA из обонятельного органа крысы.
- Исследовать электрическую активность обонятельного эпителия.
- Исследовать влияние жидких стимулов на изолированную ткань.
Используемые методы
- Удаление капсулы VNO у мыши.
- Изоляция нейроэпителия от окружающих структур.
- Размещение ткани в MEA с дендритной головкой вверх.
- Введение жидких стимулов с помощью роботизированной руки.
Основные результаты
- Успешная запись электрической активности из VNO.
- Демонстрируется устойчивая реакция ткани на жидкие стимулы.
- Предоставлен надежный метод для изучения активности сенсорных нейронов.
- Показан потенциал для дальнейших исследований сенсорной обработки.
Выводы
- Подготовка MEA эффективна для изучения обонятельного эпителия крысы.
- Роботизированная стимуляция может повысить точность эксперимента.
- Этот метод открывает пути для будущих исследований в сенсорной биологии.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput functional screening of chemosensory receptors in a native epithelial preparation, supporting target validation in olfactory and vomeronasal pathways. By combining multielectrode array recording with robotic stimulus delivery, it provides quantitative, reproducible measurements of neuronal responses to diverse ligands. This approach aids in de-risking early-stage discovery programs focused on pheromone detection, social behavior modulation, and related neuroactive compound screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of hundreds of vomeronasal receptor types in their native epithelial context.
- Operational Value: Supports ligand screening campaigns by correlating chemical stimulation with multi-neuronal electrophysiological responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers simultaneous, spatially resolved electrophysiological readouts from 60 electrodes across the vomeronasal epithelium.
- Operational Value: Enables automated, timed stimulus delivery via robotic liquid handler for consistent dose-response profiling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates exploration of sensory neuron response properties to endogenous cues such as urinary ligands.
- Operational Value: Maintains tissue viability for up to six hours, allowing extended screening windows and replicate testing.
Pipeline & Workflow Integration
This technique fits within early discovery workflows where functional validation of sensory receptors precedes lead identification and assay optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of receptor-ligand interactions through direct measurement of neuronal activation patterns.
- Screening: Provides a platform for primary screening of compound libraries against native receptor populations.
- Analytics: Generates multiplexed electrophysiological data suitable for quantifying response amplitude, latency, and frequency across neuronal subsets.
- Translational Research: Supports mechanistic understanding of accessory olfactory system function relevant to behavioral modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform for chronic or repeated ligand screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target engagement by measuring native tissue responses to physiological stimuli.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and stimulation protocols to improve inter-experiment reproducibility.
- Strategic Value: Reduces biological uncertainty in early target selection by validating receptor function in a native epithelial model.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of chemosensory targets based on functional response profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroepithelial dissection and multielectrode array handling.
- Dependent on access to planar MEA systems with compatible amplifiers and data acquisition tools.
- Necessitates integration of robotic liquid handling for precise stimulus control and timing.
- Demands environmental control (temperature, perfusion) to maintain tissue stability during recordings.
- Limited to ex vivo preparations; not applicable to in vivo or high-throughput microfluidic formats without adaptation.
