Опробование Способность к диффузии сигнальных молекул переориентировать Эмбриональные спинного спаечный Аксоны

Эксплантаты дорсальной части спинного мозга выделяют из эмбрионов крыс и культивируют в трехмерном коллагеновом геле в присутствии клеток, экспрессирующих кандидатную сигнальную молекулу. Способность сигнальной молекулы переориентировать аксоны, растущие внутри эксплантата дорсальной части спинного мозга, оценивают с помощью иммуногистохимии.

Здравствуйте, я Вирджиния Хейзен из лаборатории Саманты Батлер с кафедры биологических наук Университета Южной Калифорнии. Я Кит Фан, также из лаборатории Батлер. А я Кен Я Май из лаборатории Батлер.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру культивирования имплантатов дорсальной части спинного мозга и агрегатов трансфицированных клеток коры в коллагеновом матриксе. В нашей лаборатории мы используем этот метод для анализа способности различных молекул-кандидатов ориентировать комиссуральные нейроны спинного мозга. В данном эксперименте мы изучим способность костного морфогенетического белка или BMP 7 действовать как хеморепеллент.

Приступим к работе. Подготовьте агрегаты клеток коры, которые будут использоваться для создания препятствия на траектории роста хоральных аксонов корковых клеток, трансфицированных экспрессионной плазмидой с интересующей нас молекулой — костным морфогенетическим белком BMP 7.

Оспирируйте среду из чашки и промойте клетки 1 mL 1X PBS. Удалите PBS и обработайте клетки 0,5 mL среды для диссоциации клеток без ферментов в течение 15 минут. Остановите реакцию, добавив 1 mL среды с фетальной бычьей сывороткой.

С помощью наконечника дозатора на 1000 µL соберите клетки, пока на поверхности чашки для культивирования ничего не останется. Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение двух минут для осаждения клеток. При 2000 RPM удалите супернатант и ресуспендируйте осадок путем многократного пипетирования.

На внутреннюю поверхность крышки чашки для культивирования диаметром 35 мм нанесите несколько капель клеточного раствора по 20 µL в 100 µL среды. Закройте чашку крышкой и поместите в инкубатор на несколько часов для агрегации клеток. Для подготовки имплантатов спинного мозга из дорсальной области используйте свежевыделенный материал.

Эмбрионы крысы на стадии E 11 помещают на лед. В среде L 15 с помощью заточенной вольфрамовой иглы удаляют участок из четырех-шести сомитов из области туловища непосредственно под зачатком передней конечности каждого эмбриона. С помощью пластической пипетки собирают ткань в одну лунку четырехлуночного планшета.

Поместите чашку Петри на лед. Когда все сегменты будут препарированы, с помощью пипетки перенесите фрагменты во вторую лунку чашки Петри, содержащую среду L 15 с добавлением диска пасты. Инкубируйте ткань при комнатной температуре не более пяти минут.

Чтобы предотвратить гибель клеток, избегайте избыточного переваривания ткани. Добавьте один миллилитр свежей среды L 15 с 5% термоинактивированной сыворотки козы в третью лунку планшета. Перенесите фрагменты ткани в эту лунку.

По окончании инкубации в этом пространстве оставьте ткань на льду на один час. Чтобы облегчить последующее препарирование в микроцентрифужной пробирке, добавьте 40 µL 10-кратного минимальной среды (MEM) к 360 µL коллагена. Кратковременно перемешайте содержимое на вортексе, затем центрифугируйте в микроцентрифуге (pico fuge) для осаждения.

Раствор будет иметь желтый цвет; его следует как можно дольше держать на льду, чтобы предотвратить полимеризацию коллагена. Для каждой порции коллагена титруйте раствор 0,8 M бикарбонатом натрия до появления слабого оранжевого оттенка, перемешивая содержимое после каждого добавления. При таком цвете раствор останется жидким при хранении на льду, но будет готов к полимеризации при доведении до комнатной температуры. Если после перемешивания раствор станет розовым, начните процедуру заново, используя новую пробирку с коллагеном. Располируйте по 20 µL коллагена в каждую лунку чистого четырехлуночного планшета.

С помощью кончика пипетки распределите коллаген, чтобы сформировать небольшую подушечку. Оставьте коллаген застывать при комнатной температуре примерно на 10 минут. Под диссекционным микроскопом, используя свежезаточенную вольфрамовую иглу и тонкий пинцет, удалите вольфрамовой иглой мезодерму, окружающую спинной мозг одного из эмбрионов, затем удалите вентральную часть спинного мозга, которую можно определить по наличию пластинки дна.

На самом вентральном крае вентральная пластинка несколько толще, чем дорсальная пластинка на дорсальном крае. В данном примере спинной мозг расположен вентральной стороной вниз. Осторожно разрежьте ткань, двигаясь параллельно вентральной пластинке, и удалите вентральную пятую часть спинного мозга.

С помощью иглы вертикально разделите эксплантат спинного мозга с дорсальной стороны на две части. Убедитесь, что края разреза максимально ровные; при необходимости подрежьте их. Используя ротовой пипеточный дозатор, оснащенный стеклянной капиллярной трубкой диаметром 0,5 мм, перенесите каждый эксплантат на отдельную коллагеновую подушечку.

С помощью вольфрамовой иглы разрежьте агрегат трансфицированных клеток на квадраты, ширина которых примерно соответствует ширине латерального края дорсальной части спинного мозга. Используя ротовую пипетку, перенесите один из квадратов на коллагеновую подушечку с x эксплантом. Используйте ротовую пипетку, чтобы аспирировать излишки жидкости.

Не следует проводить избыточное аспирирование, так как небольшое количество жидкости облегчит последующее нанесение коллагена; нанесите 4 µL подготовленного коллагена на подложку. Используйте вольфрамовую иглу, чтобы переместить коллаген над имплантатами, не касаясь ткани напрямую. Перемещая иглу в коллагене, ориентируйте каждый x explan таким образом, чтобы агрегат co-клеток находился adjacent к его латеральному краю.

Дайте коллагену застыть в течение 15–20 минут. Повторите процесс нанесения еще четырех µL коллагена, чтобы убедиться, что эксплантат x полностью покрыт коллагеном, прежде чем переходить к следующему эмбриону. В стерильном боксе поместите образцы в 0,5 mL среды и культивируйте от 30 до 40 часов в инкубаторе. В вытяжном шкафу зафиксируйте эксплантаты в 0,5 mL 4% раствора параформальдегида в PBS в течение 45 минут. Держа ткань на льду, дважды промойте ее 0,5 mL блокирующего и пермеабилизирующего раствора PBTN.

Инкубируйте экспланты x в блокирующем растворе при температуре four degrees Celsius, предпочтительно в течение ночи. С помощью пинцета извлеките экспланты X из four. Well plate и поместите каждый из них в отдельную лунку планшета на 48 лунок.

Добавьте по 200 µL первичных антител в каждую лунку. Для визуализации хориальных аксонов используйте мышиные антитела к ttag, а для определения успешности трансфекции перекрестных клеток добавьте антитела к тестируемой молекуле. Инкубируйте в течение ночи при 4 °C.

Промойте каждый образец в блокирующем растворе PBTN пять раз по одному часу каждую промывку при температуре four degrees Celsius. Удалите PBTN и добавьте по 200 µL вторичных антител в каждую лунку. Накройте фольгой для предотвращения выцветания и инкубируйте в течение ночи при температуре four degrees Celsius.

Промойте образцы в PBTN пять раз, как указано ранее. Перенесите каждый эксплант на предметное стекло с тремя лунками. Удалите излишки жидкости, нанесите среду Invecta Shield и накройте покровным стеклом.

Храните предметные стекла в светозащитной папке или коробке при температуре 4 или -20 °C до момента визуализации под микроскопом. Теперь мы представим несколько репрезентативных изображений эксплантатов X после их культивирования, фиксации, окрашивания и получения снимков с помощью конфокальной микроскопии. На панели A показано, что эксплантат X крышной пластинки, обведенный белым, может переориентировать tag1-положительные хоральные аксоны в противоположном от него направлении, что доказывает, что крышная пластинка является источником хеморепеллента для аксонов. Панель B демонстрирует, что клетки co, секретирующие сигнальную молекулу M tact, костный морфогенетический белок или BMP7, могут отталкивать каркоцеральные аксоны аналогично крышной пластинке.

Аксоны эксплантатов, в которых секретируются только клетки, экспрессирующие плазмиду, не меняют свою ориентацию. Мы только что продемонстрировали вам, как препарировать, ориентировать и культивировать эксплантаты спинного мозга и использовать клеточные агрегаты, чтобы определить, обладает ли исследуемая сигнальная молекула способностью переориентировать аксоны. При выполнении данной процедуры важно максимально долго хранить коллаген на льду и полностью заключать эксплантат в коллаген, чтобы он не контактировал напрямую с культуральной средой.

И, наконец, поддерживайте культуру ровно столько времени, сколько потребуется для того, чтобы аксоны достигли вентрального края экспланта. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.