Идентификация фенотипов ингибирование роста индуцированной экспрессии бактериального типа создания эффектов III в Дрожжи

Для начала выполнения данного протокола выберите вектор для экспрессии интересующего вас бактериального эффектора. В случае использования дрожжей и конкретного штамма дрожжей вектор трансформируют в клетки дрожжей. Затем индуцируют экспрессию эффектора.

Индуцированные клетки лизируют для последующего вестерн-блот-анализа с целью подтверждения экспрессии эффектора. После подтверждения экспрессии эффектора клетки выращивают, и их десятикратные серийные разведения наносят на репрессирующую и индуцирующую среды. Наконец, через два-три дня анализируют рост дрожжей.

Здравствуйте, я До Соломон из лаборатории доктора Гвидо Чеза с факультета растениеводства Тель-Авивского университета. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру идентификации фенотипов ингибирования роста, индуцированных экспрессией бактериальных эффекторов третьего типа в дрожжах. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения функций эффекторов третьего типа грамотрицательных патогенных бактерий; этот инструмент помогает нам в идентификации мишеней эффектора TIC.

Итак, приступим. При разработке дрожжевой системы, подходящей для экспрессии интересующих нас эффекторов третьего типа, следует учитывать и оптимизировать несколько важных факторов. Первым из них является промотор, управляющий экспрессией эффекторов.

Поскольку бактериальные эффекторы III типа могут быть токсичны для дрожжевых клеток, для контроля их экспрессии следует использовать индуцибельный промотор. В данном эксперименте мы будем использовать промотор GAL1. Вторым фактором является число копий гена эффектора.

Высокие уровни экспрессии достигаются, когда эффекторный ген переносится двухмикронной плазмидой. Промежуточная экспрессия обеспечивается при использовании центромерной плазмиды, а низкая экспрессия достигается при интеграции эффекторного гена в геном дрожжей путем гомологичной рекомбинации. Третьим фактором, который следует учитывать, является эпитопная метка, используемая для подтверждения экспрессии белка в тех случаях, когда антитела к интересующему эффектору недоступны.

Обычно используются такие метки, как гемагглютинин HA или flag, для которых доступны надежные коммерческие антитела. Мы рекомендуем использовать только одну копию метки, чтобы свести к минимуму нежелательные вредные воздействия на структуру и активность эффекторного белка. И наконец, штамм дрожжей, используемый для экспрессии, должен быть тропным к селективному маркеру экспрессионного вектора.

Для выращивания дрожжевых клеток перед трансформацией выберите колонию дрожжей с свежего чашки и инокулируйте три миллилитра среды YPD в 15-миллилитровой полипропиленовой пробирке, перемешав на вортексе. Поместите пробирку с культурой в ротор и инкубируйте в течение ночи при 30 °C при постоянном вращении. На следующее утро извлеките культуру из ротора и центрифугируйте при 800 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре.

После центрифугирования полностью удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре буфера для ресуспендирования Resus, перемешивая на вортексе на максимальной скорости в течение примерно 10 секунд. Для каждой плазмиды, подлежащей трансформации, а также для дополнительного контрольного опыта, перенесите 100 µL клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку. В каждую пробирку, за исключением контрольной, добавьте пять µL одноцепочечной ДНК спермы лосося и от 250 до 500 ng плазмидной ДНК.

Затем осторожно добавьте по 650 µL раствора для трансформации в каждую пробирку и перемешайте на вортексе. Инкубируйте пробирки при 30 °C в течение 30 минут на ротаторе. По завершении инкубации добавьте по 70 µL DMSO в каждую пробирку и перемешайте, перевернув пробирки 10–15 раз, чтобы избежать разрушения клеток.

Не подвергайте пробирки вортексу. Поместите пробирки в предварительно нагретую до 42 °C водяную баню и инкубируйте в течение 15 минут. По истечении 15 минут извлеките пробирки из водяной бани и немедленно поместите их на лед на две минуты.

После охлаждения пробирок соберите клетки путем центрифугирования, затем с помощью пипеттора осторожно удалите вязкий супернатант. Ресуспендируйте каждый осадок в 150 µL стерильной дважды дистиллированной воды и высейте клеточную суспензию на чашку с соответствующей селективной средой. Оставьте чашки открытыми на две минуты для высыхания в ламинарном шкафу.

После этого поместите чашки в инкубатор при температуре 30 °C на два-три дня для выращивания клеток дрожжей. Для приготовления белкового экстракта инокулируйте 3 mL соответствующей репрессирующей среды колонией дрожжей со свежей чашки и перемешайте на вортексе. На следующий день поместите пробирку с культурой в роллер при температуре 30 °C на короткое время.

Снимите культуру с роллера и центрифугируйте при 800 Gs в течение пяти минут при комнатной температуре, удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок. Добавьте три миллилитра стерильной DDW, перемешайте на вортексе и снова центрифугируйте, после чего удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в трех миллилитрах стерильной DDW. Затем перенесите 200 microliters клеточной суспензии в новую пробирку объемом 15 milliliter, содержащую три миллилитра соответствующей индуцирующей среды, и перемешайте на вортексе.

Поместите пробирку в роллер и инкубируйте в течение ночи при 30 °C. На следующее утро перенесите 1 мл культуры (или больше, если плотность культуры низкая) в микроцентрифужную пробирку. Соберите клетки путем центрифугирования при 800 G в течение пяти минут при комнатной температуре; далее работайте в вытяжном шкафу, чтобы избежать вдыхания токсичных паров Beamer capto ethanol.

Осторожно удалите супернатант с помощью пипетора и ресуспендируйте осадок клеток в 100 µL ледяного лизирующего раствора. Тщательно перемешайте на вортексе и инкубируйте на льду в течение 30 минут. Во время 30-минутной инкубации определите объем нормальной соляной кислоты, необходимый для титрования 100 µL лизирующего буфера до pH от девяти до 10.

Для этого добавьте различные объемы соляной кислоты к 100 µL лизирующего буфера в 10 разных пробирках, а по окончании инкубации проверьте pH раствора с помощью индикаторной полоски при соответствующем объеме соляной кислоты в лизате и перемешайте с помощью вортекса. Затем добавьте 50 µL трехкратного буфера для образцов в лизат, перемешайте на вортексе, проколите иглой крышку микроцентрифужной пробирки и кипятите раствор лизата на нагревательном блоке в течение пяти минут. После кипячения дайте раствору остыть в течение двух минут при комнатной температуре.

Затем подвергните раствор лизата вортексированию и центрифугируйте в течение 10 секунд. Теперь лизат готов к иммунологическому анализу крови для подготовки клеток к методу споттинга. На следующий день вырастите культуры каждого штамма объемом по три миллилитра, как было показано ранее.

Подготовьте две чашки с синтетической полноценной средой без лейцина. Среду в одной чашке следует дополнить 2% glucose, а в другой — 2% actose и 1% raffinose. Просушите чашки в стерильном ламинарном шкафу при комнатной температуре в течение 20 минут.

Соберите клетки и ресуспендируйте каждый клеточный осадок в трех миллилитрах стерильной DDW. Повторите этап центрифугирования и снова ресуспендируйте клетки в трех миллилитрах стерильной DDW. Определите оптическую плотность (OD) каждой культуры, а затем приготовьте в стерильных микроцентрифужных пробирках суспензии клеток объемом один миллилитр с OD 600, равной единице.

Затем приготовьте три десятикратных серийных разведения для каждой из клеточных суспензий, используя три стерильные микропробирки, заполненные 900 µL стерильной деионизированной воды (DDW). Поместите сухие чашки на сетку и нанесите для каждой культуры по 10 µL из четырех разведений подряд. После нанесения оставьте чашки открытыми в ламинарном шкафу на несколько минут.

Когда пятна высохнут, накройте чашки и поместите их в инкубатор при температуре 30 °C на два-три дня. Теперь мы продемонстрируем результаты анализа споттинга дрожжей для выявления ингибирования роста. Фенотипы, индуцированные экспрессией эффекторов третьего типа — эффекторов AvrPto, HopAA1 и AvrRe1 данной бактерии.

Белки Pseudomonas Riner, патогенные для нашего томата, экспрессировали из центромерного плазмида в штамме дрожжей на репрессирующей среде. Штаммы дрожжей, несущие плазмиды для экспрессии A-V-R-P-T-O и HOP AA one one, демонстрировали рост, аналогичный контрольному штамму с пустым вектором. В то время как дрожжи, экспрессирующие AAV RE one, показали слегка сниженный рост, вероятно, из-за утечки промотора GAL one и высокой цитотоксичности AV RE one, в условиях индукции экспрессия либо AV E one, либо HOP AA one one вызывала резкое подавление роста, что выражалось в отсутствии колоний при любом разведении. Напротив, экспрессия A-V-R-P-T-O не оказывала никакого ингибирующего эффекта на рост.

Мы только что продемонстрировали вам способ идентификации фенотипов ингибирования роста, вызванных экспрессией бактериальных эффекторов третьего типа в дрожжах. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости тщательного подбора экспрессионного вектора, а также штамма, поскольку оба этих фактора могут существенно повлиять на результаты. Кроме того, помните, что на всех этапах процедуры следует использовать свежетрансформированные колонии.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.