Покадровый Визуализация Митоз После трансфекции миРНК

Изменения в клеточной организации и динамике хромосом, происходящие во время митоза, тесно координируются для обеспечения точного наследования геномного и клеточного содержимого. В этой видеостатье показан метод отслеживания знаковых событий митоза. Движение хромосом контролируется на индивидуальной клеточной основе с помощью клеточных линий, экспрессирующих флуоресцентно меченые белки.

Трансфекция с помощью ирнк направлена против митотических белков, приводит к изменениям клеточного цикла, которые могут быть визуализированы с помощью покадровой визуализации и количественно оценены с помощью анализа изображений. Здравствуйте, я Дуглас Макки из лаборатории Кэти Оман в Институте рака Хантсмана при Университете штата Юта. Сегодня мы покажем вам процедуру визуализации живых клеток по мере их прохождения через митоз после трансплантации SIA.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения любых эффектов, которые нарушение интересующих белков может оказать на сроки митотической прогрессии. Итак, приступим. Приготовьте четырехстенную лабораторию с двухкамерным покровным стеклом, добавив в каждое по 0,5 миллилитров фибронектина.

Хорошо выдерживают от 10 до 15 минут при комнатной температуре. Тем временем приготовьте комплексы irna и lip RNAI max для обратной трансфекции. Согласно инструкции производителя для каждой камеры, хорошо используйте количество, рекомендованное на одну лунку из чашки на 24 лунки.

Через 15 минут удалите фибронектин из лунок камерного покровного стекла. Затем добавьте по 100 микролитров комплексов ирнк в каждую лунку, аликвотируйте 20 000 клеток по 500 микролитров в каждую. Хорошо поместите клетки в инкубатор на 24 часа.

На следующий день замените трансфекционную смесь одним миллилитром обычной среды для культивирования клеток, затем инкубируйте клетки еще за 24 часа до получения изображения. Система получения изображений состоит из специализированного клеточного инкубатора, который помещается на столик инвертированного микроскопа, который управляется программным обеспечением для получения изображений. Чтобы подготовиться к получению изображений, убедитесь, что инкубатор заранее предупрежден и сбалансирован.

Далее откройте крышку инкубатора и поместите ячейки с закрытой крышкой камеры в адаптер. Используйте небольшое количество пластилина, чтобы удержать его на месте. Закройте крышку и установите весь инкубатор на столик микроскопа, убедившись, что инкубатор надежно закреплен на месте.

Далее, используя metamorph, настройте эксперимент, выбрав в строке меню программы пункт «Многомерное извлечение приложений». Это вызовет окно, в котором можно выбрать параметры изображения. Укажите, куда сохранять файлы данных.

Затем выберите светлопольные и m вишневые длины волн с помощью объектива с четырьмя сухими фазовыми контрастами TX, сфокусируйтесь на поле ячеек с помощью программного обеспечения, настройте функцию автофокусировки только для канала Brightfield. Это позволит программному обеспечению автоматически фокусироваться на каждой ступени перед каждой съемкой. Для первой длины волны захватите изображение Используя 50-миллисекундную экспозицию, отрегулируйте время экспозиции до минимума, необходимого для получения хорошего изображения.

Важно ограничить количество солнечного излучения для обеспечения устойчивой жизнеспособности клеток. Как правило, этого лучше всего можно достичь, используя фильтр нейтральной плотности и более длительное время экспозиции камеры. А не за счет увеличения силы освещения.

Повторите эту процедуру для любых дополнительных длин волн. Затем установите время экспозиции для каждого канала. Далее обозначьте интервал таймлапса в 15 минут в течение восьми часов в 15 позициях этапа.

Если требуется более точное временное разрешение, сократите интервал времени между сборами данных. Помните, что чем больше сценических позиций используется, тем больше времени потребуется для освоения. В каждом временном интервале выберите и отметьте соответствующее количество позиций стадий для адекватной выборки популяции клеток.

Metamor будет записывать позиции и возвращаться в указанное место для каждого приобретения. После экспозиции по длине волны была назначена информация о времени и положении сцены. Нажмите кнопку предварительного просмотра на экране, чтобы подтвердить, что программное обеспечение управляет оборудованием надлежащим образом.

Убедившись, что система функционирует, нажмите кнопку сбора данных на экране, чтобы начать сбор данных. Наблюдайте за автоматизацией по крайней мере в течение одного полного цикла сбора данных, чтобы убедиться, что все работает правильно. Затем сядьте поудобнее и позвольте компьютеру и микроскопу сделать свою работу.

Чтобы просмотреть данные, выберите приложения, просмотрите многомерные данные в строке меню, выберите представление местоположения файла, а затем выберите позицию рабочей области. Нажмите «Загрузить изображения», чтобы просмотреть стек изображений с этой позиции. После загрузки изображений используйте мышь для продвижения по данным кадр за кадром.

Здесь фильмы генерируются из митотических клеток с помощью метаморфа. Чтобы сделать фильм в Metamorph, выберите stack make movie. В строке меню выберите, какие кадры будут использоваться, скорость и тип файла фильма.

Затем нажмите кнопку Сохранить, чтобы выполнить монтаж. Сначала сохраните данные в виде файла dot STK в метаморфе. Затем откройте изображение J Откройте файл dot s stk на изображении J и обрежьте интересующую область, отметив область и выбрав обрезку изображения в строке меню.

Затем выберите стеки изображений. При монтаже укажите, какие кадры должны быть включены, размер и форма монтажа. И желательны ли межкадровые границы.

Затем нажмите «ОК». Сохраните монтаж в виде файла dot tiff. Наконец, рассчитайте время на каждой стадии митоза, обозначающее рамку, в которой проявляется первый признак конденсации ДНК или округления клеток, поскольку T равно нулевой профазе.

Прометафаза заканчивается, когда хромосомы выравниваются на экваторе, метафаза будет продолжаться до тех пор, пока ДНК не начнет разделять анафазную телофазу. И, наконец, следует цитокинез и клетки начинают сплющиваться. Покадровая визуализация прикорневых клеток, экспрессирующих его камень.

Показано H два BCFP. Эти клетки были трансфицированы контрольной ирнкой и нормально протекали по клеточному циклу. Для сравнения, клетки, которые были трансфицированы миРНК, направленными против ядерной поры, NUP 1 53 вытесняют серьезные изменения в прогрессировании MIT.

Мы только что показали вам, как настроить, запустить и проанализировать эксперимент по покадровой визуализации, чтобы определить время митотической прогрессии клеток после трансфекции. При выполнении этой процедуры важно быть как можно более бережным к клеткам, поддерживая надлежащую температуру и концентрацию CO2, а также ограничивая количество света, воздействию которого подвергаются клетки. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.