Пластиковые вложения и секционирования Xenopus laevis Эмбрионы

Пластиковые разделы сохранить истинный морфологии ткани в тонких срезов тканей, которые могут быть immunostained с люминесцентными вторичными антителами, что делает этот метод более полезным, чем парафин или замороженных срезов для многих типов тканей. Метод окрашивания, пластик вложение и секционирования показано в этом видео.

Здравствуйте, меня зовут Сочи ота. Я являюсь научным сотрудником в лаборатории доктора Кена Чо на факультете биологии развития и клеточной биологии Калифорнийского университета. Ирв I Сегодня я покажу вам приготовление простого среза эмбриона ксенопуса.

Эта процедура включает в себя бисекцию эмбриона лягушки на поздней стадии газа, окрашивание антителом против исследуемой молекулы, инфильтрацию в пластик и создание такого же пластического сечения размером пять микрон. Эта процедура может быть использована для изучения иммунофлуоресценции, иммуногистохимии или гибридизации in situ с изображением с очень высоким разрешением. Хорошо, это маленькие удобные инструменты, которые я использую для пластического разрезания эмбриона 10 и более эмбрионов.

Это металлический пинцет с дельта-кончиком, а этот, номер один, с его помощью можно ориентировать зародыш в пластике. И во-вторых, это можно использовать вместе с этой кистью для переноса эмбриона из микротома на монтажную поверхность. Это изолятор из силиконовой резины, который я помещаю на поверхность предметного стекла и который создает водяную тягу, куда я могу установить ломтики пластиковых рассеченных эмбрионов.

Теперь я показываю, как разделить эмбрион пополам, фиксированный эмбрион для анализа, такого как гибридизация или обнаружение иммунофлуоресценции. А чтобы разрезать зародыш пополам, я использую эту очень тонкую пустынную сетку, которую можно купить в продуктовом магазине. Я думаю, что да, есть фиксированные эмбрионы, фиксирующие клетки на 3,7% формального максимума за ночь.

И то, как вы это исправите, зависит от цели. Это устраняется в одночасье. С целью инцизионной гибридизации можно пойти на ночную фиксацию, но для обнаружения иммунофлюоресценции, при которой вы обнаруживаете белок внутри эмбриона, я не рекомендовал слишком длительную фиксацию.

И я предпочитаю фиксировать высоту формы 3,7% в течение всего двух часов, чтобы свести к минимуму влияние на субклеточную локализацию белка, а также избежать чрезмерной фиксации, чтобы обеспечить хорошее проникновение антитела на этапе обнаружения. Хорошо, теперь я препарирую этот эмбрион через стену взрыва, разрезая левую и правую сторону. Итак, теперь я вижу, что это эмбрион 11 стадии, где PO проходит весь путь от дорсальной стороны до вентральной стороны, но у него есть эмбрион.

И давайте посмотрим на эту правую руку. Вы видите взрыв как на дорсальной, так и на вентральной стороне, но дорсальная сторона очевидна, потому что эта инвагинация явно проникает в самую глубокую, глубокую внутреннюю часть эмбриона по сравнению с вентральной стороной. Так что это хороший кусок, хороший кусок пополам для изучения как дорсальной, так и вентральной стороны.

Внутри эмбриона, этого препарированного эмбриона, я собираюсь использовать иммунофлуоресцентное обнаружение белка, экспрессируемого внутри эмбриона. А для иммунофлюоресценции или иммуногистохимии вы используете специфические антитела для обнаружения. Но проблема в том, что антитела не очень хорошо проникают внутрь эмбриона.

Так что, если вы используете целую гору, целую гору эмбриона, вы не можете знать. Вы не можете изучить характер экспрессии белков у эмбриона. Но с помощью этого предварительно разделенного пополам эмбриона вы можете изучить, каков паттерн экспрессии в клетке глубоко внутри эмбриона.

, окрашенный в пятна эмбрион уже зафиксирован на 3,7%. Формальдегид обезвожен в этанол и проник в пластик, который называется техно 7, 100. И этот набор состоит из трех частей, которая является основной частью жидкости и этого порошка, который называется отвердителем. И называется эта жидкость отвердителем два.

Сначала я смешиваю эту основную часть и отвердитель с соотношением 100 к одному, что даст вам эту смесь для проникновения. И вот что есть, то есть жидкость, в которую я проникаю этим эмбрионом. И это еще жидкость, чтобы она еще не застыла.

И вот эти образцы эмбрионов оставляют в этой инфильтрационной смеси на ночь, чтобы убедиться, что образец эмбриона полностью обобщен в этом пластике. Теперь я беру этот образец эмбриона с помощью трансферной пипетки и переношу в тонкостенную пробирку 0,5 MPCL, которую я использую в качестве формы для встраивания. Затем из этого зародыша удаляю лишнюю жидкость.

И теперь этот зародыш, этот зародыш уже готов к встраиванию в затвердевающий пластик. Чтобы сделать затвердевающий пластик, вы смешиваете эту инфильтрационную смесь с этой затвердевающей трубкой в соотношении 15 к одному. Так, например, если я возьму 750 микролитров этой инфильтрационной смеси для основания трубки, то я должен добавить 50 микролитров этого отвердителя, чтобы инициировать полимеризацию пластика после его добавления, ой, закройте крышку и затем аккуратно перемешайте вот так.

И не стоит делать вихрь, потому что кислород является ингибитором реакции полимеризации. Добавьте к зародышу примерно 250 микролитров этой смеси. И этот этап полимеризации занимает почти четыре часа, которые вы должны, вам совсем не нужно спешить.

После добавления этого полимеризующего пластика сначала вы можете трубить вверх и вниз, чтобы зародыш плавал в пластике. И теперь я беру этот металлический пинцет, чтобы надавить на эмбрион, чтобы сориентировать его так, чтобы режущая поверхность эмбриона доходила до дна этой формы для встраивания. Затем закройте крышку, потому что кислород является ингибитором реакции отверждения, и оставьте ее на четыре часа, чтобы дать возможность реакции отверждения.

После этого это уже стадо в образце HUD. Вы наносите клей на этот образец, чтобы убедиться, что эта пластиковая твердая часть не выйдет из этой формы. Это, это еще один пластик, который работает как клей для этой цели, называется техно 30 40.

И я смешиваю этот порошок и жидкость с 2, 2, 1 вот 0,6 грамма этого порошка. Итак, я собираюсь добавить 300 микролитров этой жидкости, затем быстро перемешать ее, и этот пластик довольно быстро становится твердым. Итак, это часть, вы должны быть немного жестче, а затем налить это к этому уже услышанному образцу.

Этого достаточно. Закройте крышку. Я выгляжу так.

И это займет примерно от 30 до 60 минут, чтобы стать твердым. И это тот, который готов к действию. Сначала я вырезаю кончик формы картонным ножом, эту часть кончика снимаю с этой формы.

Так что теперь эти внедренные эмбрионы обнажены. И еще я отрезал этот колпачок, потому что он мне не нужен. Теперь я беру эту иглу tain Roy, я имею в виду не лезвие tain Roy, которое тверже, чем обычное лезвие для окрашивания, используемое для разрезания parin.

Я кратко погружаю его в Синь, чтобы сделать его чистым. Установите это на держатель лезвия и сотрите излишки заина. И иногда я убираю эту область с помощью зайна, потому что чистота этой области абсолютно важна.

Теперь он готов к секционированию. Перед началом секционирования я настраиваю монтажную камеру. Итак, это слайд-стекло.

И вдобавок ко всему, я вставляю силиконовую резину и толкаю фермера до упора, чтобы не было, не было никакой утечки. И ставим это на горку грелку и заливаем этой чистой лечебной водой, чтобы сделать наш бассейн. И налейте столько воды, сколько вы получите, пока не получите поверхность поверхностных вод затопления.

И это важно, потому что эта поверхность паводковых вод обеспечивает равномерное распределение поверхностного натяжения воды, что важно для равномерного расширения участка. Сейчас я делаю секции, но перед этим я надеваю эту маску, потому что каждая секция такая легкая, такая легкая и моя, моя грудь может сдуться со сцены. Поэтому я ношу эту маску.

А теперь приступаем к секционированию. После того, как вы получаете какое-то количество секций на сцене, вы берете их кистью и медленно перемещаетесь по вершине этой горной камеры и стучите этой кистью, чтобы эти детали попали в воду под действием силы тяжести. И как только они приземляются на воду, они расширяются, образуя круглый кусок на поверхности воды.

Как этот свет после ночного высыхания. Теперь это выглядит вот так и вот так. Теперь образец готов к контакту с DPI для ядерной ДНК.

А потом можно изучать под микроскопом. Сегодня я показал вам приготовление пластикового среза с использованием эмбриона лягушки на поздней газовой стадии. Эта процедура весьма полезна для изучения субклеточной или локализации белка, которая не может быть изучена с помощью метода встраивания парен, а также в целом даже для остаточной гибридизации.

Этот пластиковый срез также дает вам даже для остаточной гибридизации, эта процедура может дать вам гораздо более высокий уровень изображения, чем скобочный или замороженный образец среза.