Подготовка Олигомерные β-амилоида 1-42 И индукция Synaptic Обесценение Пластичность на срезах гиппокампа
14 июля 2010 г.
Одной из особенностей болезни Альцгеймера является повышение Ар 1-42 Пептида. Здесь мы предлагаем протокол для подготовки синтетических Ар 1-42 Олигомеров, что снижает гиппокампа долговременной потенциации, сотовые коррелят памяти. Эта процедура полезна для исследования механизмов Ар-индуцированной скрининга патологии и наркотиков.
Синтетический бета-амилоид 1-42 ресуспендируют в HFIP для предварительной мономерзации пептида, после чего концентрируют до образования пленки для лигирования. Пленку РЕЗУСПЕНДИРУЮТ в DMSO, разводят в фосфатном буфере и инкубируют в течение ночи. Наконец, олигомерный пептид разводят регистрирующим буфером и перфузируют на острые срезы гиппокампа, где оценивают влияние воздействия бета-амилоида на синаптическую пластичность.
Добро пожаловать в лабораторию Авио Орио в Колумбийском университете в Нью-Йорке. Здравствуйте, сегодня мы продемонстрируем процедуру, которую мы оптимизировали для подготовки олигомеров бета-амилоида, основанную на протоколе, первоначально предложенном Штайном и коллегами в 2003 году. В этой лаборатории мы использовали данный метод для изучения синаптической дисфункции, индуцированной бета-амилоидом.
Итак, приступим. Дайте флакону с лиофилизированным порошком бета-амилоида выстоять при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы избежать конденсации при его открытии в вытяжном шкафу. Откройте флакон и добавьте ледяной HFIP, чтобы получить конечную концентрацию бета-амилоида 1 mM.
Закройте флакон и перемешайте содержимое на вортексе, затем с помощью шприца Hamilton быстро разделите раствор равными порциями между тремя микроцентрифужными пробирками из полипропилена с низкой сорбционной способностью. Закройте пробирки и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре для перемешивания пептида, после чего откройте пробирки и поместите их в вакуум-концентратор для концентрирования раствора. Центрифугируйте при 800 Gs под вакуумом в течение примерно 15 минут.
Убедитесь, что температура не превышает 25 °C, чтобы избежать деградации белка. Центрифугирование считается завершенным, когда на дне пробирки видна прозрачная сухая пленка пептида. Пленку может быть трудно заметить; запечатайте пробирки и храните неиспользованные аликвоты при температуре −80 °C до шести месяцев. В вытяжном шкафу добавьте DMSO, чтобы ресуспендировать пептидную пленку до конечной концентрации 5 мМ, и обработайте ультразвуком в водяной бане в течение 10 минут.
Для обеспечения полного восстановления пептида храните аликвоты по 1,6 µL 5 мМ раствора бета-амилоида при -20 °C. Каждую аликвоту следует размораживать только один раз. Накануне проведения эксперимента разморозьте одну аликвоту 5 мМ раствора бета-амилоида и добавьте 98,4 µL стерильного фосфатного буфера до конечного объема 100 µL; перемешайте на вортексе в течение 30 секунд и инкубируйте при 4 °C в течение 12 часов. Чтобы начать эксперимент по лигандизации, инкубируйте свежий лизат гиппокампа в течение 90 минут.
В стандартном регистрирующем буфере стимулирующий электрод помещают на коллатерали Шафера, а регистрирующий электрод — в stratum radiatum. После обнаружения ответа и стабилизации базовой линии в течение 10 минут разведите бета-амилоид до концентрации 200 nM. Поскольку в регистрирующем буфере бета-амилоид неспецифически связывается со стеклом, по возможности используйте пластиковую посуду.
Проводите перфузию срезов раствором бета-амилоида в течение 20 минут. Примените выбранную стимуляцию тоном X. Например, тета-пакет сразу после тетануса, после чего вернитесь к перфузии обычным регистрирующим буфером.
Продолжайте мониторинг записи в течение как минимум двух часов после тетануса, чтобы подтвердить индукцию LTP и оценить эффекты воздействия бета-амилоида. Мы только что продемонстрировали способ приготовления олигомерного бета-амилоида 1-42 для индукции нарушения синаптической пластичности в срезах гиппокампа. При выполнении данной процедуры важно помнить, что чрезмерное высушивание пептидной пленки может привести к неполной агрегации.
Также крайне важно использовать пластиковую посуду для растворов бета-амилоида, чтобы предотвратить неспецифическое связывание пептида. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол приготовления синтетических олигомеров Aβ 1-42, которые, как известно, нарушают долгосрочную потенциацию в гиппокампе — ключевой механизм, связанный с памятью. Эта процедура имеет важное значение для изучения патологии, индуцированной Aβ, а также для целей скрининга лекарственных препаратов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Клеточная биология
- Исследование болезни Альцгеймера
Теоретические основы
- Болезнь Альцгеймера характеризуется повышенным уровнем пептида Aβ 1-42.
- Олигомеры Aβ 1-42 участвуют в развитии синаптической дисфункции.
- Долговременная потенциация (LTP) является клеточным коррелятом памяти.
- Понимание воздействия Aβ может помочь в разработке лекарственных препаратов.
Цель исследования
- Представить детальный протокол синтеза олигомеров Aβ 1-42.
- Исследовать механизмы синаптических нарушений, индуцированных Aβ.
- Обеспечить возможность скрининга лекарственных препаратов для потенциального лечения болезни Альцгеймера.
Используемые методы
- Ресуспендирование синтетического бета-амилоида в HFIP.
- Концентрирование пептида до состояния пленки для лигаментизации.
- Ресуспендирование в DMSO и инкубация в фосфатном буфере.
- Оценка воздействия бета-амилоида на острые срезы гиппокампа.
Основные результаты
- Подготовленные олигомеры Aβ 1-42 эффективно нарушают синаптическую пластичность.
- Данный протокол обеспечивает воспроизводимые результаты при изучении синаптической дисфункции.
- Полученные данные способствуют пониманию роли Aβ в патологии болезни Альцгеймера.
- Потенциальное применение в скрининге лекарственных препаратов для лечения болезни Альцгеймера.
Выводы
- Протокол синтеза олигомеров Aβ 1-42 является эффективным и надежным.
- Данное исследование расширяет понимание влияния Aβ на процессы, связанные с памятью.
- Будущие исследования могут основываться на этих результатах для изучения терапевтических возможностей.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Нарушение синаптической пластичности гиппокампа, индуцированное олигомерным β-амилоидом1-42, представляет собой надежную, релевантную заболеванию модель для исследований ранних стадий болезни Альцгеймера. Данная парадигма позволяет снизить механистические риски и повысить прогностическую уверенность при валидации мишеней и скрининге соединений для коррекции синаптической дисфункции. Этот подход способствует приоритизации портфеля исследований, уточняя трансляционную значимость потенциальных методов терапии, направленных на патологию, вызванную амилоидом.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать синаптическую дисфункцию, вызванную амилоидом, в контролируемой системе ex vivo.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишени путем количественной оценки нарушения LTP после воздействия олигомерного β-amyloid.
- Способствует механическому снижению рисков при проверке гипотез о болезни Альцгеймера на синаптическом уровне.
- Предоставляет платформу для повышения прогностической достоверности при оценке соединений на ранних стадиях.
Скрининг и разработка анализа
- Устанавливает воспроизводимый метод анализа для количественной оценки нарушения синаптической пластичности в срезах гиппокампа.
- Стандартизирует приготовление и применение олигомерного β-амилоида для получения стабильных результатов анализа.
- Позволяет надежно оценивать потенциальные соединения по их способности смягчать нарушение LTP.
- Обеспечивает масштабируемость и повторное использование платформы для инициатив по высокопроизводительному скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует механизмам развития заболевания, которые задействованы в ранней патологии болезни Альцгеймера.
- Обеспечивает преемственность от взаимодействия с молекулярной мишенью до функциональных результатов в синапсах.
- Обосновывает решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков, связывая эффекты соединений с трансляционными биомаркерами здоровья синапсов.
- Поддерживает выбор и валидацию доклинических моделей для последующих исследований in vivo.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод связывает этап раннего поиска с доклинической валидацией, позволяя проводить проверку гипотез, снижение рисков при выборе мишени и количественную оценку синаптической функции в ответ на воздействие амилоида.
- Фундаментальная биология: облегчает проверку нулевой гипотезы о синаптических нарушениях, вызванных амилоидом, и уточнение механизмов соответствующих путей.
- Скрининг: предоставляет стандартизированный, воспроизводимый метод анализа для оценки соединений, противодействующих нарушению долговременной потенциации (LTP).
- Аналитика: обеспечивает количественные показатели синаптической пластичности для достоверного статистического сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: связывает результаты ex vivo с биомаркерами соответствующих заболеваний и доклиническими конечными точками.
- Корпоративное повторное использование: предлагает многократно используемый рабочий процесс для текущей валидации мишеней и кампаний по скринингу в портфелях исследований нейродегенерации.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней болезни Альцгеймера.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость анализов синаптических нарушений.
- Стратегическая ценность: оптимизирует процесс принятия решений «продолжать/прекратить» и эффективность использования капитала за счет сосредоточения внимания на функциональных исходах, имеющих значение для заболевания.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию и продвижение активов по нейродегенерации с учетом скорректированных рисков.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с пептидами, подготовки срезов гиппокампа и проведения электрофизиологических записей.
- Необходим доступ к специализированному оборудованию для измерения LTP (длительной потенциации) и системам контролируемой перфузии.
- Требуется строгая стандартизация протоколов приготовления пептидов и проведения анализов между исследовательскими группами.
- Может потребоваться адаптация для различных модельных систем или классов соединений в зависимости от их растворимости и свойств связывания.
- Практические ограничения включают вариабельность агрегации пептидов и чувствительность к условиям эксперимента.
