Два-Фотон основе Фотоактивация в Живом данио рерио Эмбрионы

Общая цель следующего эксперимента заключается в фотоактивации определенного светочувствительного агента, такого как химически заблокированный («в клетке») флуоресцентный краситель, в живом эмбрионе данио-рерио с разрешением до одной клетки. Это достигается путем инъекции светочувствительного агента в эмбрионы на стадии одной клетки, экспрессирующие живой генетический маркер для локализации и точного нацеливания на любые интересующие клетки. На втором этапе эмбрионы выращивают и закрепляют в низкоплавком агарозе, которая иммобилизует живой эмбрион.

Далее используется двухфотонная микроскопия для локализации видимого флуоресцентного трансгенного маркера. Затем светочувствительный агент активируется в выбранной фокальной плоскости, и степень фотоактивации контролируется. После этого можно проследить судьбу полученных меченых клеток на более поздних стадиях эмбрионального развития.

Данная процедура может быть использована для активации различных соединений с разрешением до одной клетки в живых образцах. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими, такими как конфокальная микроскопия или импульсная лампа, является возможность фотоактивации в относительно глубоких тканях с осевым разрешением в несколько микрон при сравнительно низкой фототоксичности. Представленный здесь метод используется для трассировки клеточных краев и может быть применен для фотоактивации различных компонентов, что позволяет осуществлять направленный контроль над процессами развития и физиологическими процессами. Накануне инъекции подготовьте нерестовые аквариумы, отделив самцов и самок данио-рерио трансгенной линии, экспрессирующей видимый флуоресцентный маркер.

В данном эксперименте трансгенная линия экспрессирует GFP под контролем нейрогенного промотора N1. Разморозьте аликвоту 5% декстрана, конъюгированного с «заклетчатым» (caged) флуоресцеином в 0,2 молярном растворе хлорида калия на льду. Разведите «заклетчатый» флуоресцеин в 0,2 молярном растворе хлорида калия до конечной концентрации 1%. Держите флуоресцеин на льду и защищайте от света. Дождитесь спаривания перекрестов данио-рерио, соберите оплодотворенные икринки сразу после их откладки и промойте их, как описано в тексте. С помощью пластической пипетки перенесите эмбрионы на стадии одной клетки на планшет для инъекций с 1% агарозой, покрытый свежей средой E3, под dissecting microscope.

С помощью пипетки расположите эмбрионы в желобах для инъекций. Отломите кончик капиллярной инъекционной иглы с длинным конусом. Используя наконечник микрозагрузчика, заполните иглу сзади примерно 1 µL 1% caged fluorescein.

Поместите заполненную иглу в микроманипулятор, подключенный к пневматическому микроинжектору. Введите в цитоплазму каждой клетки по два-три нанолитра caged-флуоресцеина. Инъекции следует провести как минимум в 50 эмбрионов за один эксперимент.

Перенесите инъецированные эмбрионы в чашку Петри со свежей средой E three и инкубируйте в темноте при 28.5 °C до достижения нужной стадии развития. Для ингибирования пигментации через 24 часа добавьте к эмбрионам 0.1% Phenyl threa в preparation к монтированию эмбрионов. Покройте 15–20 чашек Петри диаметром 60 мм тонким слоем 1% Aros, растворенного в свежей среде E two. После застывания Aros заполните чашки средой E two под диссекционным микроскопом.

С помощью остроконечного пинцета перенесите инъецированные эмбрионы на покрытые чашки. Избегайте воздействия воздуха на эмбрионы. Держите аликвоту 2% низкоплавящегося агарозы в воде.

В термоблоке при 72 °C. Используя пастеризованную огневым методом пипетку, перенесите один покрытый эмбрион в объеме примерно 150 µL среды в чашку Петри диаметром 60 мм. Поместите аналогичный объем 2% Agros рядом с эмбрионом и быстро смешайте две капли для получения гомогенной капли 1% Agros.

Ориентируйте эмбрион так, чтобы его дорсальная сторона была обращена к объективу. Дайте агарозе затвердеть, затем погрузите эмбрион в среду E2. Поместите свежемонтированный эмбрион на держатель для планшета под двухфотонный микроскоп, оснащенный широкополосным поворотным лазером.

Перед началом процесса фотоактивации получите серию изображений от наиболее вентрального до дорсального края экспрессирующей ткани при длине волны 860 нм. Сделайте снимки с шагом 6 мкм по плоскости Z. Выберите целевую плоскость Z для фотоактивации и сфокусируйтесь на ней, используя GFP в качестве ориентира.

Найдите интересующую область. Сделайте один снимок при 860 нанометрах и оставьте его открытым в отдельном окне для точного совмещения. Крайне важно, чтобы лазер на 720 нанометрах находился в режиме синхронизации мод перед открытием меню редактирования обесцвечивания.

Используйте изображение, полученное на длине волны 860 нанометров, для определения области интереса (ROI) для фотоактивации. В окне редактирования обесцвечивания (edit bleach) настройте относительную мощность лазера, количество итераций и скорость сканирования. Для проведения фотоактивации нажмите кнопку bleach, когда лазер остановится, переключитесь обратно на 860 нанометров и получите изображение одной плоскости, чтобы оценить интенсивность полученного фотоактивированного материала.

Соберите стек изображений для оценки z-сечения или толщины активированного домена. Таким образом можно эмпирически определить интенсивность лазера и продолжительность экспозиции. Для оптимальной фотоактивации каждого клона или перекрестной фотографии активируйте все оставшиеся эмбрионы, необходимые для эксперимента.

В этих условиях выращивайте закрепленные фотоактивированные эмбрионы в темноте при 28,5 °C в среде E2, содержащей 0,1% фенилтиомочевины, до достижения ими нужной стадии развития. Под диссекционным микроскопом с помощью острого скальпеля сделайте V-образный надрез в агарозе рядом с закрепленным эмбрионом так, чтобы основание надреза было направлено к голове эмбриона. Поместите закрытые пинцеты в точку надреза.

Осторожно раскройте пинцет, раздвигая хорион вдоль тела эмбриона, чтобы освободить его в среду. После извлечения каждого эмбриона соберите его в микроцентрифужную пробирку с помощью пастуровской пипетки с оплавленным концом. В вытяжном шкафу зафиксируйте эмбрионы в 4% formaldehyde в течение трех часов.

При комнатной температуре проведите обезвоживание, регидратацию, окрашивание с использованием щелочной фосфатазы, конъюгированных антител к флуоресцеину и все сопутствующие промывки, как описано в сопроводительном тексте. Добавьте к эмбрионам 500 µL отфильтрованного раствора Fast Red. Инкубируйте в темноте при комнатной температуре, заменяя раствор Fast Red на свежий каждый час до достижения желаемого соотношения сигнал/фон.

Остановите реакцию окрашивания, проведя три промывки в PBST по пять минут каждая. В вытяжном шкафу зафиксируйте окраску в 4% formaldehyde в течение 20 минут. Промойте дважды в PBST по пять минут каждая.

Промойте прозрачные эмбрионы через серию градиентов глицерина 25%, 50% и 75% в PBS до тех пор, пока каждый эмбрион не осядет на дно пробирки. Храните эмбрионы при температуре four degrees Celsius до начала визуализации под микроскопом. Для монтажа эмбрионов с целью визуализации используйте шприц объемом one milliliter, чтобы нанести четыре капли прозрачной силиконовой смазки по 20 microliter на предметное стекло по углам квадрата со стороной 15 millimeter.

Поместите эмбрион в примерно 200 µL 75% глицерина между каплями вазелина. Накройте эмбрион покровным стеклом. Осторожно надавите на покровное стекло вертикально вниз, пока раствор глицерина не заполнит всё пространство.

Эмбрионы, закрепленные в каплях жира, можно хранить в течение нескольких дней при температуре 4 °C перед визуализацией с помощью конфокальной микроскопии. На данном изображении показан живой эмбрион zebrafish, экспрессирующий GFP под контролем промотора neurogenin1, в которого на стадии одной клетки был введен краситель-трассер на основе клетки-флуоресцеина с использованием описанного выше метода на стадии от 3 до 5 сомеритов.

Отдельный участок первичного мозга был фотоактивирован двухфотонным лазером, после чего был обнаружен высвобожденный флуоресцеиновый краситель-трекер. После процедуры фотоактивации эмбрион инкубировали при 28.5 °C, и через 24 часа после оплодотворения клетки мозга, содержащие высвобожденный флуоресцеин, были отслежены с помощью иммуноокрашивания антифлуоресцеином красного цвета. Обратите внимание на небольшое количество меченых клеток. После освоения процедура фотоактивации может быть выполнена всего за несколько часов. При выполнении данной процедуры важно помнить о контроле оптимальных параметров, что позволяет проводить точную фотоактивацию с разрешением до одной клетки.