Прямое возобновление репликации Форк блокировалось Головой об РНК-полимеразы

Общая цель данной процедуры заключается в наблюдении за судьбой зоны репликации и РНК-полимеразы (RNAP) после лобового столкновения. Это достигается путем первоначальной сборки транскрипционного комплекса на биотинилированной ДНК и его иммобилизации на планшете Stripp и гранулах, что приведет к образованию остановленного комплекса элонгации RNAP. Вторым этапом процедуры является лигирование предварительно подготовленной раздвоенной ДНК к комплексу элонгации RNAP для формирования репликационной вилки ниже по течению от лобового столкновения с RNAP.

Третьим этапом процедуры является сборка зоны репликации и инициирование синтеза лидирующей цепи в репликационной вилке. Заключительным этапом процедуры является выделение ДНК с магнитных частиц и очистка ДНК с помощью колонки для очистки продуктов ПЦР. В конечном итоге, при помощи щелочного агарозного геля очищенных радиоактивно меченных продуктов ДНК, можно получить результаты, демонстрирующие остановку росо при столкновении с фронтальным транскрипционным комплексом.

Здравствуйте, я Ричард Померанс из лаборатории Майка О'Доннелла в Университете Рокфеллера. Сегодня я продемонстрирую вам процедуру столкновения рибосомы с РНК-полимеразой «лоб в лоб» в твердой фазе. В нашей лаборатории я использую этот метод для изучения того, как процесс репликации подвергается влиянию транскрипционных комплексов вдоль ДНК.

Приступим к работе. Для начала данного протокола смешайте голофермент РН-полимеразы с биотинилированной матрицей ДНК размером 3,6 KB, содержащей промотор T7 A1, в 100 µL буфера А; инкубируйте смесь в течение 10 минут при 37 °C. После 10-минутной инкубации добавьте рибонуклеотиды аденозинтрифосфат, цитидинфосфат и уридин, чтобы ограничить синтез РНК до 20 нуклеотидов.

Инкубируйте раствор еще в течение 10 минут при 37 °C для иммобилизации остановленного комплекса элонгации РН-апезы на бусинах. Добавьте раствор к магнитным бусинам, покрытым стрептавидином. Инкубируйте смесь в течение 10 минут при комнатной температуре.

Очистите иммобилизованный комплекс остановленной элонгации РНП, промыв гранулы 0,9 мл буфера с высоким содержанием соли. Чтобы удалить неспецифические комплексы РНП-ДНК после каждой промывки, удалите супернатант с помощью магнитной сепарации. Эту процедуру промывки следует повторить пять раз.

Затем гранулы следует промыть еще дважды 0,9 мл буфера A. После окончательной промывки можно собрать нижележащую репликативную вилку, чтобы сформировать репликативную вилку ниже по течению от RNAP, идущей навстречу. Ресуспендируйте магнитную полоску с гранулами, прикрепленными к остановленному комплексу элонгации RNAP, в 100 мкл буфера 4 от New England Biolabs. Затем добавьте 10 единиц щелочной фосфатазы из креветок (SAP) и инкубируйте образец в течение 10 минут при 37 °C. Промойте гранулы трижды 0,9 мл буфера A. Затем ресуспендируйте гранулы в 50 мкл буфера для реакции быстрой лигирования T4.

Добавьте 2 µL лигазы Quick T4 и предварительно подготовленную раздвоенную ДНК, затем инкубируйте раствор в течение 10 минут при комнатной температуре. В завершение промойте гранулы еще три раза 0,9 мл буфера A. Смешайте гексамер, ДНК-хеликазу с магнитными стрептавидин-гранулами, которые присоединены к остановленному комплексу элонгации РНП и нижележащей репликационной вилке. Приготовьте раствор в 150 µL буфера A и инкубируйте его в течение 30 секунд при 23 °C.

После короткой 32-й инкубации при 23 °C добавьте к полимеразе III бета-зажиму A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P, DGTP, меченный α-P³², и DATP, меченный α-P³², до объема 200 µL. Инкубируйте образец в течение пяти минут при 37 °C.

Запустите репликацию, добавив белок, связывающий одноцепочечную ДНК, DCTP и DTTP. Также добавьте меченые α P 32 DTTP и DCTP до конечного объема 250 microliters. Через 10 минут остановите реакции, добавив 12 microliters 0.5 molar EDTA.

Затем прокипятите гранулы со стрептавидином, чтобы высвободить ДНК из гранул. Удалите остаточную ДНК, обработав гранулы протеиназой K в течение 30 минут при 50 °C. Снова прокипятите гранулы и удалите супернатант с помощью магнитной сепарации.

Очистите объединенный супернатант, содержащий ДНК, с помощью набора для очистки продуктов ПЦР Kyogen. В завершение проанализируйте очищенные радиоактивно меченные продукты ДНК в щелочном агарозном геле. Столкновение зоны с идущей навстречу РНП обычно приводит к образованию двух продуктов длиной 2,5 KB и 3,6 KB. Продукт длиной 2,5 KB соответствует длине ДНК от вилки до остановленной РНП.

Это происходит из-за остановки репликации при столкновении с РНП. Продукт размером 3,6 KB представляет собой полноразмерную ДНК и образуется либо вследствие неполного заполнения промотора РНП, либо частичного прохождения репликации через РНП при лобовом столкновении. Хорошим результатом считается получение примерно 50% полноразмерной ДНК.

Однако в некоторых случаях наблюдается меньшая степень заполнения промотора РНК-полимеразой (RNAP), что приводит к более высокому проценту полноразмерной ДНК. Это объясняется тем, что при отсутствии заблокированной RNAP большее число зон репликации не сталкивается с РНК-полимеразой при лобовом столкновении, в результате чего образуется только полноразмерная ДНК. Мы только что продемонстрировали, как проводить репликацию в твердофазном методе в присутствии заблокированного комплекса элонгации РНК-полимеразы, связанного с ДНК. При выполнении этой процедуры важно промыть заблокированный транскрипционный комплекс раствором с высокой концентрацией соли, чтобы удалить избыток РНК-полимеразы, которая неспецифически связывается с ДНК и ингибирует репликацию.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.