Измерение 50% Гемолитическая Дополнение (CH ₅₀) Активность сыворотки

Измерение 50% гемолитической активности комплемента сыворотки (CH 50). Вам понадобятся дозаторы на 200 µL и 1000 µL, исследуемая сыворотка, хранившаяся на льду, сенсибилизированные эритроциты овцы, фосфатно-солевой буфер, дистиллированная вода, пробирки для исследуемой сыворотки, а также пробирки для определения базового лизиса и полного лизиса, вортексный смеситель и 96-луночный планшет с плоским дном. Маркируйте пробирки индивидуально: контрольную и пробирку с конечным разведением. В данном случае мы начинаем с разведения 1:8.

Продолжите проводить двукратные разведения, чтобы получить разведения 1:16, 1:32, 1:64 и 1:128; остальные пробирки пометьте как «бланк» (blank) и «полный лизис» (total lysis). После того как все пробирки будут промаркированы, можно приступать к разведению исследуемой сыворотки. Начните с переноса 300 µL солевого буфера R в чистую пробирку.

Теперь перенесите 100 µL сыворотки в 300 µL солевого буфера R. Это позволит получить исходный разведение в соотношении один к четырем. Убедитесь, что образец сыворотки тщательно перемешан.

Теперь перенесите 200 µL фосфатно-солевого буферного раствора в предварительно маркированные пробирки. Также добавьте 200 µL фосфатно-солевого буферного раствора в две холостые пробирки для общего лизиса. В них добавьте 200 µL дистиллированной воды вместо фосфатно-солевого буферного раствора.

Теперь перенесите 200 µL сыворотки, разведенной в соотношении 1:4, в пробирку с маркировкой 1:8. Ранее мы перенесли по 200 µL фосфатно-солевого буфера в серию пробирок от 1:8 до 1:128. Таким образом, будет получен разведение 1:8.

Тщательно перемешайте образец, затем перенесите 200 µL в пробирку под номером один, указанную в пункте 16. Повторяйте процедуру до тех пор, пока не будет разведена вся серия пробирок. Удалите 200 µL из пробирки с разведением 1:28, чтобы конечный объем составил 200 µL.

Сенсибилизированные эритроциты овцы могли осесть с течением времени. Их необходимо ресуспендировать, осторожно несколько раз перевернув пробирку. После тщательного ресуспендирования перенесите 200 µL сенсибилизированных эритроцитов овцы в каждую из подготовленных пробирок.

Убедитесь, что сыворотка тщательно перемешана с эритроцитами. Сенсибилизированные эритроциты овец, добавленные в контрольную пробирку (blank), позволят определить спонтанный лизис, а кровь, добавленная в пробирку для полного лизиса, позволит определить значение 100%. Используя вортекс на низких оборотах, аккуратно перемешайте каждую из пробирок. Затем поместите пробирки в водяную баню при 37 °C и инкубируйте в течение 30 минут.

По истечении 15 минут инкубации осторожно еще раз перемешайте содержимое пробирок на вортексе и инкубируйте еще 15 минут. После инкубации перенесите пробирки в центрифугу, установленную на температуру 4 °C, и центрифугируйте при 1500 G в течение пяти минут. После центрифугирования осторожно извлеките пробирки и поместите их в подходящий штатив. Здесь вы увидите осадок эритроцитов, в то время как SNA будет иметь красный цвет.

Для анализа переноса гемоглобина внесите 100 µL дистиллированной воды в нужное количество лунок плоской 96-луночной планшетки. Осторожно, избегая захвата осадка, перенесите 100 µL супернатанта в соответствующую лунку 96-луночной планшетки. После того как все образцы будут внесены в планшетку, измерьте абсорбцию с помощью планшетного спектрофотометра при длине волны 540 nm.

Здесь представлены необработанные данные абсорбции для двух повторностей: A1 и B1. Обратите внимание на разведение 1:8.

Затем у нас есть данные для разведений 1:16, 1:32, 1:64 и 1:128. A6 и B6 представляют собой холостую пробу, в то время как A7 и B7 — полный лизис.

После сбора данных необходимо рассчитать среднее значение абсорбции для каждой дубликатной пробы. Затем из всех образцов вычтите абсорбцию холостой пробы, которая представляет собой спонтанный лизис. Когда все данные будут собраны, можно рассчитать процент лизиса для каждого разведения, используя следующую формулу.

После расчета всех данных постройте график зависимости процента лизиса на вертикальной оси от разведения сыворотки на горизонтальной оси. Полученный график можно использовать для определения разведения сыворотки, необходимого для лизиса 50% сенсибилизированных эритроцитов овцы. На данном графике процент лизиса отложен в зависимости от кратности разведения сыворотки.

Затем можно провести линию от отметки 50%лизиса до ее пересечения с кривой. В точке пересечения с кривой проводится вертикальная линия вниз к горизонтальной оси. Это значение представляет собой кратность разведения, до которой необходимо развести сыворотку, чтобы обеспечить 50%лизис; при сравнении двух образцов сыворотки для определения различий в CH 50 в качестве показателя можно использовать разведение, при котором достигается 50%лизис.