Исследование тканей и органов конкретных Фитохром ответы с помощью FACS-помощь камерного типа Конкретные профилирования выражения в Arabidopsis thaliana

Для изучения ответов фитохромов в специфических типах растительных клеток использовали ловушку энхансеров GAL 4G FP и трансгенные линии U-A-S-B-V-R, скрещивая их для получения растений с дефицитом фитохрома. Протопласты листьев потомства скрещивания U-A-S-B-V-R и GA 4G FP выделяют из растений.

Затем протопласты сортируют по факторам для выделения GFP-отрицательных и GFP-положительных протопластов в отдельные образцы, после чего выделенные протопласты анализируют с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Чтобы подтвердить сбор GFP-положительных протопластов, из них экстрагируют РНК и проводят спектральный анализ. Здравствуйте, я Санка Пивар из лаборатории БАРДА Монтгомери в отделе энергетических исследований растений при Университете штата Мичиган.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру выделения протопластов листьев Arabidopsis thaliana для проведения флуоресцентной сортировки клеток и анализа экспрессии генов в конкретных типах клеток. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения ткане- и органоспецифических фитохром-зависимых ответов. Итак, приступим.

Линия Arabidopsis ANA, использованная в данной процедуре, была получена методом бипартитной ловушки энхансеров от двух родительских линий. Одна из них взята из библиотеки линий с ловушками энхансеров с различными паттернами экспрессии gal. Первая родительская линия также экспрессирует GFP под контролем вышележащей активирующей последовательности (UAS).

Вкратце, фактор транскрипции GAL4 активирует любой ген, находящийся под контролем UAS. В родительской линии 1 GAL4 активирует GFP; родительская линия 1 была скрещена с родительской линией 2, в которой ген BVR находится под контролем GAL4 через UAS.

Линия, полученная в результате скрещивания, — U-A-S-B-V-R cross G 4G FP. В родительских линиях биосинтез хромофора фитохрома протекает от LA через гем до биливердина, сокращенно bv. Однако в потомстве продукт гена BVR блокирует биогенез хромофора фитохрома путем восстановления предшественника BV. Данная линия потомства BVR с энхансер-ловушкой была подтверждена и может быть использована для изучения того, как снижение уровней активного фитохрома влияет на различные ткани растений.

Начните выполнение данной процедуры с подготовки почвы и горшков для выращивания растений с целью последующего получения протопластов листьев. Посейте стерилизованные семена (около 2000 на образец для одного эксперимента) в почву в горшках. Добавьте воду в нижнюю часть поддона с горшками и накройте весь поддон пластиковой пленкой.

Выращивайте растения в течение пяти недель при белом освещении при температуре 22 °C и влажности 70%. После первых пяти-шести дней, когда подтверждается прорастание семян, с лотка снимают пластиковую пленку. Для выделения протопластов сначала приготовьте буфер TEX: для одного литра буфера отвесьте пять солей GA's B: MES, хлорид кальция, нитрат аммония и сахарозу.

Полностью растворите компоненты примерно в 900 миллилитрах деионизированной дистиллированной воды (сокращенно DD H2O) и доведите pH до 5.7 с помощью одного молярного раствора KOH. Затем доведите конечный объем до одного литра и проведите стерилизацию путем фильтрации.

Затем соберите с растений здоровые зеленые листья. Наберите в стакан около 250 миллилитров листьев, упаковывая их неплотно. Промойте листья 40 миллилитрами.

Промойте четыре раза в DD H2O, затем дважды промойте стерильной DD H2O, используя скальпель № 20. Нарежьте листья на тонкие полоски и равномерно распределите ткань по двум стерильным пластиковым пробиркам объемом 50 мл. Рабочий раствор (1x) для переваривания листьев готовят путем добавления 5 мл аликвоты 10-кратного (10x) стокового раствора, полученного путем растворения 2% (масс./об.) мацераза R 10 и 4% (масс./об.) целлюлаза на azua R 10 в буфере TEX, к 45 мл свежего буфера TEX.

Добавьте около 25 milliliters раствора для переваривания листьев 1x. Перемешайте содержимое пробирок так, чтобы все полоски листьев были полностью покрыты раствором. Выполните вакуумную инфильтрацию тканей листьев раствором для переваривания.

Перемешивайте в открытых пробирках в течение одного часа при комнатной температуре, используя вакуумный эксикатор, подключенный к водяному насосу. Держите пробирки с тканями листьев и смесью для переваривания листьев обернутыми в алюминиевую фольгу для предотвращения воздействия света. Затем проведите трехчасовую инкубацию при комнатной температуре на рокер-шейкере при осторожном встряхивании.

Через три часа увеличьте скорость перемешивания на ротаторе на две минуты, чтобы высвободить протопласты. Профильтруйте суспензию сырых протопластов через два слоя стерильной марли для удаления детрита и соберите фильтрат в стерильный стеклянный стакан. Профильтруйте фильтрат через стерическую нейлоновую сетку с размером ячеек 100 мкм в стерильную чашку Петри.

Соберите фильтрат и перенесите его в новую стерильную пробирку объемом 50 мл. Используйте около 15 мл свежего буфера TEX для промывки стерильной чашки Петри и сбора всех протопластов, прилипших к поверхности. Центрифугируйте фильтрат при 100 ×g при температуре 10 °C в течение 15 минут, используя центрифугу с ротором с размахом, установив ускорение на шесть, а торможение — на ноль по завершении центрифугирования.

Используйте стерильную стеклянную пипетку длиной девять дюймов, подключенную к перистальтическому насосу, чтобы удалить около 25–30 мл жидкости под слоем плавающих протопластов, содержащей остаточный и осажденный дебрис, не затрагивая сам слой протопластов; в пробирке должно остаться около 10–50 мл. После удаления осажденного дебриса добавьте свежий буфер TEX до конечного объема 40 мл. Аккуратно ресуспендируя протопласты, повторите процедуру удаления дебриса и ресуспендирования оставшихся плавающих протопластов.

Повторите процедуру еще дважды, чтобы максимально удалить клеточный дебрис. Время центрифугирования сокращается до 10 минут при первом повторении и до пяти минут при окончательном повторении. В завершение с помощью стерильной переносной пипетки объемом один миллилитр аспирируйте плавающие протопласты и перенесите их в новую пробирку объемом 15 миллилитров.

Переходите непосредственно к сортировке перед началом процесса. Кратко изучите протопласты с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM), используя лазер с длиной волны 488 нм для возбуждения, чтобы подтвердить целостность протопластов и наличие флуоресценции GFP в пуле протопластов. Необходимо минимизировать количество клеточного дебриса, чтобы избежать засорения сопла сортировщика; сортируйте изолированные протопласты в буфере TEX с помощью FACS.

Используя сопло диаметром 200 мкм на макросортировочной головке при частоте событий от 6 000 до 15 000 и системном давлении около 9 PSI в соответствии с адаптированным протоколом, используйте протопласты дикого типа без GFP для определения порогов автофлуоресценции с целью сбора GFP-положительных протопластов. Сортировку клеток проводите с помощью аргонового лазера, работающего при мощности 100 мВт на линии 488 нм. Для идентификации флуоресценции GFP используйте полосовой фильтр 530/30 после сбора GFP-положительных протопластов. Снова изучите отсортированные протопласты под микроскопом, как это делалось до начала сортировки, для профилирования экспрессии.

Выделите общую РНК из отсортированных протопластов. Затем можно подготовить кДНК для гибридизации. Полученную кДНК используют для гибридизации с полногеномными микрочипами TH one OPSYS Ametri.

Ниже представлены репрезентативные результаты сортировки протопластов контрольной группы дикого типа. В гейте GFP-положительных клеток сигналы отсутствуют. Однако в образцах протопластов, выделенных из линий GAL 4G FP, идентифицируются GFP-положительные сигналы; при этом в анализе методом CLSM протопласты, выделенные из растений дикого типа, не проявляют никакой GFP-флуоресценции.

В образцах протопластов линий GAL 4G FP после сортировки обнаруживается смесь протопластов с GFP-флуоресценцией и без неё. Анализ методом КЛСМ подтверждает выделение GFP-положительных протопластов из репрезентативной линии GAL 4G FP; из выделенных протопластов можно экстрагировать РНК, при этом один миллилитр дает количество РНК, достаточное для детекции с помощью флуоресцентной спектрометрии. Мы только что продемонстрировали вам способ выделения протопластов листьев Arabidopsis thaliana для сортировки клеток с помощью флуоресценции и анализа экспрессии генов в конкретных типах клеток.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости бережного обращения с протопластами и ограничении их воздействия света. На этом все. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.