Экспериментальные Пробирной метастазы

Общая цель данного эксперимента заключается в проверке метастатических способностей раковых клеток человека путем инъекций в хвостовую вену. У мышей с иммунодефицитом клетки подготавливают к инъекции. Затем клетки вводят мышам с иммунодефицитом, которые генерируют метастазы в легких через один-два месяца.

Мышей препарируют, а метастазы в легких количественно оценивают и культивируют. Результаты этого вида анализа указывают на степень метастазов того или иного типа раковых клеток. Здравствуйте, меня зовут Сонали Моханти из лаборатории доктора LE на кафедре биомедицинской генетики Университета Рочестера.

Сегодня мы покажем вам процедуру проведения экспериментального анализа метастазирования. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения метастазирования рака. Итак, приступим.

Начните с клеток, выращенных примерно до 70% Co fluency, аспирируйте среду из тарелки и аккуратно промойте один раз одним XPBS. Далее добавьте два миллилитра 0,05%-ного инвертирующего трипсина. Осторожно покачивайте пластину, чтобы облегчить отслоение клеток.

Наблюдайте за клетками под микроскопом, как они отделяются. Добавьте достаточный объем носителя, содержащего FBS, чтобы утолить время в активности. Затем переложите в трубку объемом 50 миллилитров.

Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. После того, как концентрация будет определена, центрифугируйте со скоростью, примерно в 200 раз превышающей силу тяжести, в течение трех минут, не нарушая клеточную гранулу. Осторожно удалите из среды Resus, суспендируя соответствующий объем балансового буферного раствора Хэнка или HBSS, чтобы достичь конечной концентрации примерно в пять раз по 10 до шести клеток на миллилитр.

Затем профильтруйте через сетчатое фильтр Falcon размером 70 микрометров. Чтобы исключить крупные клеточные агрегаты, поместите наконечник пипетки прямо на фильтр, помещенный над пятимиллилитровой питательной пробиркой. Быстро вытолкните суспензию через фильтр в трубку.

Снова подсчитайте ячейки, используя триановый синий, чтобы определить жизнеспособность. Жизнеспособность должна быть более 90% до введения. Затем разбавляют до конечной концентрации 2,5 раза по 10 до шести клеток на миллилитр.

Держите на льду. Осторожно возьмитесь за хвост мыши с иммунодефицитом и втяните его в удерживатель мыши так, чтобы она прижалась спиной к щели, а хвост торчал из небольшого отверстия в задней части. Медленно сдвиньте кольцо внутрь вдоль щели.

Как только кольцо зацепится за рот мыши, зафиксируйте его на месте. Мышь не должна иметь возможности свободно двигаться, но должна иметь нормальную частоту дыхания. Найдите основные хвостовые вены.

В хвосте мыши присутствуют четыре основных кровеносных сосуда. Артерии расположены на дорсальной и вентральной сторонах хвоста. Вены расположены по боковым сторонам.

Наберите не менее 200 микролитров подготовленных клеток в одномиллилитровый шприц. Прикрепите полуиглу 30 калибра и вытолкните все пузырьки воздуха. Конечный объем в шприце должен составлять 200 микролитров.

Приготовьтесь к введению в дистальный конец хвоста. Таким образом, если первая попытка не удастся, более проксимальная область хвоста может быть использована для второй попытки. Протерев место инъекции 70%-ным этанолом, вытяните хвост прямо.

Держите кончик большим пальцем и поддерживайте точку для инъекции указательным пальцем. Введите иглу в вену и введите клетки. Во время инъекции убедитесь, что игла и шприц расположены параллельно вене

В противном случае игла будет протыкаться через стенку сосуда и клетки будут вводиться в соседние ткани хвоста. Извлеките иглу, если процедура прошла успешно. Кровь должна перфузировать из места инъекции.

Нажмите на чистый ватный тампон, чтобы облегчить использование зубной нити, и прощупайте хвост вверх, чтобы пропустить остаточный образец в циркуляцию. Освободите мышь от ограничителя и верните ее в клетку. Запишите количество попыток инъекции и количество введенных клеток в лабораторную тетрадь.

Определяют жизнеспособность клеток после инъекции. Как и раньше, этот шаг дает уверенность в том, что клетки остаются живыми на протяжении всего процесса инъекции. В конце эксперимента с инъекцией жизнеспособность клеток снизится, но должна оставаться выше 80%.

Затем заморозьте гранулы при температуре минус 80 градусов Цельсия для будущих анализов, таких как вестерн-блоттинг. Через один-два месяца препарируйте мышей, чтобы определить места расположения метастазов. Начните с помещения усыпленной мыши на станцию для вскрытия.

Щедро сбрызните мышь этанолом. Разрежьте грудную клетку, чтобы обнажить легкие и сердце. Затем аккуратно вырезаем их и помещаем в PBS.

Легкое является основным местом метастазирования, поскольку в нем находится первое капиллярное русло, с которым сталкиваются клетки. После того, как они попадут в кровоток, удалите сердце и промойте легкие в PBS, а затем осмотрите каждую долю легкого под препарирующим микроскопом. Подсчитайте количество обнаруживаемых метастазов с обеих сторон легкого, затем количество метастазов в легких на всех четырех долях вместе, чтобы определить общее количество метастазов в легких.

Далее изолируют отдельные метастазы в легких путем иссечения с помощью ножниц. Перенесите каждый метастаз в клеточный фильтр размером 70 микрометров и измельчите его, используя конец стерильного колпачка иглы. Промойте клеточное фильтр несколькими миллилитрами среды и соберите клетки, которые проходят через фильтр.

В чашке для культивирования каждая чашка содержит клетки одного метастаза. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее четырех дней без каких-либо нарушений. Первоначально на пластинах будут расти как раковые клетки, так и клетки фибробластов, но постепенно клетки фибробластов будут отмирать и заменяться раковыми клетками.

Если раковые клетки несут какие-либо устойчивые к лекарствам гены, выберите клетки с соответствующими антибиотиками Через три дня смойте все остатки крови или тканей, мусор на чашке с помощью PBS и добавьте свежую среду. Здесь оценивают чистоту полученных клеток с помощью иммуноокрашивания антителами против специфических для человека белков, а античеловеческие ментальные антитела используют даже при отсутствии подбора лекарств. Более 99% клеток должны быть человеческими.

Вновь полученные клетки теперь могут быть снова введены иммунодефицитным мышам для проверки их метастатических способностей в конце этого анализа. Высокометастатическая раковая клеточная линия обычно приводит к возникновению многих метастазов в легких, в то время как очень немногие метастазы в легких происходят от слабометастатической линии раковых клеток. На этих изображениях видны метастазы в легких через два месяца после инъекции клеточной линии меланомы человека.

А 3 7 5 см. Клетки, полученные с помощью этого метода, обычно дают начало большему количеству метастазов, чем родительская линия. Опять же, используя этот анализ, мы только что показали вам процедуру проведения экспериментального анализа метастазирования.

При проведении этой процедуры очень важно помнить о том, что клетки вводятся в хвостовую вену, а не в ее и хвостовую ткань. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.